细菌学检查

细菌学检查

（一）细菌的分离培养

1．培养基制作的原则和一般步骤

（1）培养基制作的原则培养基是人工方法将多种物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料，一般用以分离和培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基等。在制作培养基时应掌握如下原则和要求：

①培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质。

②必须彻底灭菌,不得含有任何活细菌。

③培养基的材料和盛培养基的容器上,没有抑制细菌生长的物质。

④所制备培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状和其它代谢活动所产

生的变化。

⑤培养基的酸碱度应该符合细菌的生长要求，多数细菌生长适宜范围是弱碱

（pH7.1~7.6）。

（2）培养基制备的一般过程不同的培养基其制备方法不同，一般要经如下步骤：

①根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基。

②精确称量各种成分。

③将各种成分按规定加热溶解，调整pH到适宜的范围内。再加热煮沸10~15分钟（注意补加液体的损耗）

④过滤（用滤袋或纱布棉花），分装、灭菌（不同的培养基的灭菌温度和时间不同，通常为15磅压力下15~30分钟）

⑤培养基中的某些成分，象血清、腹水、糖类、尿素、氨基酸、酶等，在高温下易分解，变性，故应用滤菌器过滤，再按规定的温度和量加入培养基中。

⑥无菌检验，取作好的培养基数管，置37℃恒温箱内24小时，若无细菌和霉菌生长即可使用。

2．细菌的分离培养

在细菌学诊断中，细菌的分离培养是不可缺少的一环，分离培养的目的是在病料中由多种细菌里挑选出可疑菌。在分离培养之前，首先应该注意下列事项：（1）选择适合于所含分离细菌生长的培养基。

（2）培养温度一般在37℃，但应考虑特殊细菌对温度的要求。

（3）考虑所分离的细菌是需氧性或厌氧性，进一步决定培养条件。

（4）初步分离时发现有多种细菌，应进一步选择可疑菌落进行纯培养

（二）细菌的接种

1．平板划线法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是将被检材料作适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：

（1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指将皿盖揭开成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。

（2）右手持接种环，将材料少许涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与涂材料之处轻轻接触，开始划线。（3）划线时先将接种环稍稍弯曲，这易和平皿内琼脂平行，不致划破培养基。（4）划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。

（5）平皿盖向下，在培养皿上标注样品名称、编号、接种日期后，置温箱中培养。

2．斜面接种法

3．液体培养基接种法

（三）细菌培养性状观察

1．细菌在液体培养基中生长性状观察

（1）浑浊度观察是否透明，轻度浑浊，中度浑浊或极度浑浊，还有均匀浑浊，颗粒状浑浊，絮状浑浊。

（2）沉淀试管底有无沉淀，沉淀物呈颗粒状，粘稠状或絮状。轻摇时云雾状，絮状或发辫状开起。

（3）表面有无菌膜及附着于管壁的菌环。

（4）色素及气味

2．细菌在固体培养基上菌落生长性状观察

（1）大小各种细菌菌落大小差异很大，菌落直径在1毫米以下为露滴状菌落；1~2毫米为小菌落；2~4毫米为中等大菌落；4~6毫米或更大为大菌落。

（2）形状有圆形、规则形、根足形、菌丝状等。

（3）边缘有整齐、锯齿状、纤毛状、卷发状等。

（4）表面有光滑、湿滑、粗糙、颗粒状、皱丝状、同心状、放射状等。

（5）降起度有角平、隆起、脐状、扭扣状。

（6）颜色有无色、白色、灰白色、金黄色、柠檬色、绿色、红色等。

（7）透明度有透明、半透明、不透明等。

（四）显微镜检查——细菌抹片制备、染色及镜检

细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

常应用各种染料对细菌进行染色，由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用，以及离子交换，酸碱等化学作用，染料就能使细菌着色，且因细菌细胞的结构和化学成分不同，而含有不同的染色反应。

1．细菌抹片的制备

进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：

（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有油渍，可按下列方法处理：

①滴上95%酒精2~3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几

次。

②若上法仍未能去除油渍，可再滴上1~2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。

（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压积或涂抹成一薄片。

如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一张玻片上有秩序地排好，作多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留标本片，应贴标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

（3）干燥上述涂片，应让其自然干燥。

（4）固定有两类固定方法。

①火焰固定将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。

②化学固定血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨（Giemsa）染色，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2~3 分钟，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2~3分钟后，自然挥发干燥。抹片如作瑞特氏染色（Wright’s stain），则必先须作特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。

将抹片固定的目的有如下几种：

①除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附玻片，以免水洗时易被冲掉

②使抹片易于着色或更好地着色，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力较

强。

③可能杀死抹片中的微生物。

必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片时，应严格慎重处理染色用过残液和抹片本身，以免引起病原的散播。

固定好的抹片，即可进行各种方法的染色。

2．几种常用染色方法

常用的细菌染色方法，主要有两种类型：

（1）简单染色法只应用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。

（2）复染色法应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用。染色后不同的细菌和物体，或者细菌构造的不同部分可以呈现不同的颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆萨染色法。

①美蓝染色法在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖涂抹点即可）美蓝染色液，经1~3分钟，水洗，干燥（可用吸水纸吸干，或自然干燥，但不能烤干），镜检。