检测差异表达基因技术的研究进展

[收稿日期]1999204219;[修回日期]1999207227

[作者简介]金慧英(1966-)女,江苏南京市人,助理研究员,硕士,主要从事微生物学方面的研究。

[文章编号]100028861(2000)04(S )20111203

检测差异表达基因技术的研究进展

Advance of study on the iden tify i ng d ifferen ti a l expressi ng gene

金慧英(J I N H u i 2ying ),房德兴(FAN G D e 2x ing )

(南京军区军事医学研究所,江苏南京210002)

[摘　要]　随着差异表达基因检测技术的不断发展,建立了很多新的检测方法,本文对mRNA 差异显示技术(DDR T 2

PCR )、c DNA 示差分析技术(c DNA 2RDA )及抑制消减杂交技术(SSH )的基本原理及工作流程作了综述,并介绍了它们的应用状况和特点,这些方法的建立和广泛应用可望发现更多的差异表达的基因,并通过其与表型的关系分析加快人们对基因功能的认识。

[关键词]　mRNA 差异显示(DDR T 2PCR );c DNA 示差分析(c DNA 2RDA );抑制消减杂交(SSH )[中图分类号]　Q 78 [文献标识码]　A

近年来现代分子生物学技术,特别是核酸杂交技术、反转录技术、PCR 扩增技术的发展为建立简便高效的检测差异表达基因的方法奠定了坚实的基

础。从L I AN G (1992)[1]

建立的m RNA 差异显示技术(DDR T 2PCR ),L IS IT SYN (1993)[2]建立并由

HU BAN K (1994)[3]

改进的c DNA 示差分析技术

(c DNA 2RDA )到D I A TCH EN KU (1996)[4]

建立的抑制消减杂交法(SSH ),差异表达基因的检测技术越来越简便,且特异性更强,灵敏度更高。现就上述3种方法的原理、工作流程、应用及展望简述如下:1　基本原理及工作流程

111　m RNA 差异显示技术(m RNA differen tial disp lay reverse tran scri p ti on PCR ,DDR T 2PCR )　m RNA DDR T 2PCR 的基本原理是合成两对引物,通过随机组合,使每种m RNA 均有扩增机会,并显示出清晰的电泳带。为达到该目的,利用真核细胞m RNA 均含po ly (A )末端以及po ly (A )上游2个碱基只有12种组合(A T 、A C 、A G 、T T 、TC 、T G 、CT 、

CC 、CG 、GT 、GC 、GG ,即42

个组合除去TA 、CA 、

GA 、AA 4个组合)的特点,设计3’

引物T 11-12M N (M N 2A 、G 、C 、T 中的任一种,M 不能为T ),分别与总m RNA 进行反转录,从而获得12份c DNA ;再以c DNA 为模板,以上述T 11-12M N 为下游引物,以另一随机寡核苷酸引物(如10m er 随机引物)为上游引物进行PCR 扩增。理论上,5’端引物随机结合在c DNA 上,且每一条c DNA 均有扩增机会,获得大

小不同的扩增片段。扩增时掺入同位素标记的单核苷酸,扩增结束后,经序列分析PA GE 后进行放射自显影,如果模板c DNA 存在差异,即可显示差异表达的DNA 片段,最后可通过回收目的DNA ,经

杂交、克隆、测序进行鉴定。工作流程(见图1。

)图1mRNA DDR T 2PCR 工作流程图

F ig 1Schem atic diagram of mRNA DDR T 2PCR

112　c DNA 示差分析(c DNA 2rep resen tati onal

difference analysis ,c DNA 2RDA )　c DNA 2RDA 是HU BAN K 和SCHA T Z (1994)在L IS IT SYN 等(1993)建立的基因组DNA 示差分析技术(rep resen tati onal difference analysis ,RDA )基础上改进而来,它是将差减杂交与PCR 相结合的技术。利用双链DNA 为模板时可通过PCR 呈指数扩增,而单链DNA 为模板时则呈线性扩增的原理,首先制备tester c DNA 和driver c DNA ,并用识别序列为4碱基的限制性核酸内切酶(如Dp n 或Sau 3A )消化成平均长度为256bp 的c DNA 片段。随后接上寡核苷酸接头(adap to r R )并按adap to r R 序列设计引物进行PCR 扩增,使两组的c DNA 得到富集,制备扩增子(am p licon s )。由于Dp n 或Sau 3A 的识别序列(GA TC )较常见,这样设计可确保几

乎所有表达基因至少有一次被扩增机会。然后切除接头,只在tester c DNA 片段的5’端接上新接头,接着将其与大大过量的driver DNA 混合进行变性

免疫学杂志第16卷第4期2000年7月　

　I M M UNOLO G I CAL JOU RNAL V o l 16N o 4Ju ly 2000 S 111

和复性,并以新接头为引物进行PCR 扩增,只有与driver DNA 有差别的tester c DNA 片段才能自身退火,从而在PCR 产物中得到富集。连续进行3次差减杂交,彻底从tester 中去除与driver 相同的基因,最后利用PCR 技术富集tester c DNA 中特异表达的基因。工作流程(见图2)

。

图2c DNA 2RDA 工作流程

F ig 2Schem atic diagram of c DNA 2

RDA 113　抑制消减杂交法(supp ressi on sub tractive

hyb ridizati on ,SSH )　抑制杂交法是以抑制PCR 为

基础的c DNA 消减杂交方法,所谓抑制PCR ,即利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅2柄”结构,无法与引物配对,从而选择性地抑制非目标序列的扩增。该技术首先提取两种细胞(或组织)的m RNA ,并反转录获得c DNA ,经适当限制性核酸内切酶(如R sa 或H ae 酶)酶切,产生大小适当的平端c DNA 片段,分别制备tester c DNA 和driver c DNA ;将tester c DNA 分为均等两份。各自连接上两种长序列接头,再将过量driver c DNA 分别加入两份tester c DNA 中,变性后退火,获得4种杂交产物:①单链tester c DNA ;②双链tester c DNA ;③异源双链c DNA ;④双链driver c DNA 。这一步骤使单链tester 均等化并富集差异表达的基因,然后合并两份杂交产物,另加上新的变性单链driver c DNA ,再次退火杂交,在这次杂交中,

只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链tester c DNA 能与driver c DNA 一起形成各种双链分子,并产生新的双链分子e ,这种分子的两个5’端有两个不同的接头,使其在以后的PCR 中被有效扩增。两次杂交后,填平粘性末端,利用巢式PCR 原理,将两个长接头片段设计成内外两对引物,先用外侧引物,然后用内侧引物分别进行PCR 反应,使最后PCR 产物绝大部分是e 型分子,从而获得差异表达的基因

。工作流程(见图3)。

图3SSH 工作流程

F ig 3Schem atic diagram of SSH

2　应用状况与展望

211　DDR T 2PCR 的应用　1992年L I AN G 等首先报道了m RNA DDR T 2PCR ,并用该方法比较了培

养在同一条件下的人乳房上皮正常和癌细胞m RNA ,发现S 1带和S 2带仅出现在正常细胞内,M 1仅出现在癌细胞中。之后,m RNA DDR T 2PCR 技术得到了广泛的应用,JAM ES 等用12组引物对小鼠未着床早期胚和胚囊期胚进行了DDR T 2PCR 分析,证明胚胎发育不同阶段,m RNA 表达的质和量是不同的。潘美辉[5]1997年应用该技术分析了人胎脑组织不同部位基因表达的差异及其特异表达的基因片段,发现了多个差异表达的基因及产物。孟祥文[6]同样应用DDR T 2PCR 技术研究了具不同转移

S 112 第16卷免疫学杂志2000年7月