猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素的研究进展

猪胸膜肺炎放线杆菌Ａｐｘ毒素的研究进展

张欣，马魁，罗满林

（华南农业大学兽医学院，广东广州

５１０６４２）

收稿日期：２００６－０５－１７

ＡＰＰ是引起猪传染性胸膜肺炎的致病菌。该

菌为革兰氏阴性，有荚膜的短小球杆菌。根据其生长营养需要，可将该菌分为两个生物型，即生物Ⅰ型（Ｎ

ＡＤ依赖型）和生物Ⅱ型（ＮＡＤ非依赖型）。迄今所知ＡＰＰ共有１５个血清型，即１～１５型，其中

５型又分为５ａ和５ｂ亚型。由于部分血清型菌株

的脂多糖具有相同的Ｏ侧链，因而存在部分抗原交叉反应，如血清１／９／１１、４／７、５／６。不同的血清型致病性有所不同，可能与其毒力有关。其中血清

１、５、９和１１四种血清型毒力最强，而血清３和６

型则被认为毒力较弱。在ＡＰＰ致病机制中有多个因子的参与，包括荚膜多糖、脂多糖（ＬＰＳ）、外膜蛋

白、转铁结合蛋白、蛋白酶、渗透因子及Ａｐｘ毒素。其中Ａｐｘ毒素是主要的毒力因子，也是主要的免疫原［１］，因此有关Ａｐｘ毒素的研究已成为该病的研究热点。

Ａｐｘ毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌分泌的一类

溶血毒素。血清型毒力的强弱与Ａｐｘ毒素种类有关。ＡＰＰ的１５个血清型共产生四种溶血毒素［２］：Ａｐｘ

Ⅰ、ＡｐｘⅡ、ＡｐｘⅢ、ＡｐｘⅣ。它们都属于ＲＴＸ毒素

（ｒｅｐｅａｔｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏｘｉｎ，ＲＴＸ）家族。四种

毒素都具有ＣＡＭＰ效应，即与金黄色葡萄球菌共培养时，其溶血效应会加强［３］。其中产ＡｐｘⅠ和ＡｐｘⅡ毒素的血清型毒力最强。在ＡＰＰ的致病过程中Ａｐｘ毒素的作用是溶解红细胞，但是它还具有调节白细胞活性的功能。这对于它在猪传染性胸膜肺炎致病过程中尤为重要。

１ＡｐｘⅠ毒素

在ＡＰＰ感染过程中，会产生有活性的毒素

ＡｐｘＩ。ＡｐｘＩ毒素具有很强的溶血活性。其相对分

子量为１０５ｋＤａ，同时它对肺泡巨噬细胞和嗜中

性白血球也具有很强的细胞毒性作用。研究表明血清型１、５、９、１０、１１产生ＡｐｘＩ。ＡｐｘＩ操纵子是由激活基因ＡｐｘＩＣ、结构毒素基因ＡｐｘＩＡ、分泌必需基因ＡｐｘＩＢ和ＡｐｘＩＤ四个基因组成的，即ＡｐｘＩ－ＣＡＢＤ。

这是一个典型的ＲＴＸ毒素的操纵子。在操纵子中，各基因的功能不同。ＡｐｘＩＡ基因编码毒素蛋白的前体，ＡｐｘＩＣ基因编码毒素翻译后的激活物，

ＡｐｘＩＢＤ基因负责毒素的分泌。ＡｐｘＩ操纵子被转录

成两种ＲＮＡ：一种大小为３．５ｋｂ，由Ｃａ２＋诱导，含有ＡｐｘＩＣ和ＡｐｘＩＡ的ＲＮＡ，它占主要地位；另一种

大小为７．５ｋｂ，不是由Ｃａ２＋诱导，它包含整个操

纵子ＡｐｘＩＣＡＢＤ的ＲＮＡ［４］。

在不同的血清型中，可能存在ＡｐｘＩ毒素基因的同源性。Ｆｒｅｙ利用克隆以及限制性酶切分析了

１、９和１１型的ＡｐｘＩ毒素基因的同源性。发现三

者的同源性很高，但是这三种血清型与血清５ａ、

５ｂ、１０、１１型的ＡｐｘＩ基因存在明显的差异。虽然

这两组基因在限制性酶切片段上的差异已达到了

５％，但是它们所表达的两组毒素的结构非常相似。

到目前为止，还没有单克隆抗体能够将它们区分开来［５］。严克霞等［６］利用毒性极强的ＡＰＰ２１菌株表达的ＡｐｘＩＡ毒素，并且与天然毒素做了免疫原性比较。结果表明，天然毒素和复性的重组表达蛋白均具有良好的免疫原性，对小鼠具有较好的免疫保护效力。

２ＡｐｘⅡ毒素

ＡｐｘⅡ有较弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞

摘要：猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）引起的细菌性呼吸道传染病。Ａｐｘ毒素（ａｃｔｉｎｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｔｏｘｉｎ）是由胸膜肺炎放线杆菌分泌的一类溶血毒素，在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中，Ａｐｘ毒素起了重要的作用。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌；Ａｐｘ毒素

中图分类号：Ｓ８５２．６１＋９

文献标识码：Ａ

文章编号：１００５－８５６７（２００６）０５－００１５－０３

广东畜牧兽医科技２００６年（第３１卷）第５期研究进展

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和嗜中性白血球也具有细胞毒性作用。其分子量为１０３ｋＤａ。除血清型１０和１４外，其他血清型都分泌ＡｐｘⅡ毒素。已经证实ＡｐｘⅡ操纵子仅包含激活基因ＡｐｘⅡＣ和结构蛋白基因ＡｐｘⅡＡ，但没有分泌蛋白Ｂ和Ｄ基因。其实，在ＡｐｘⅡ基因中，还存在短截的ＡｐｘⅡＢＤ的操纵子。正是ＡｐｘⅡＢＤ操纵子的存在，在ＡｐｘⅡＡ的分泌过程中起到了反式互补的作用［７］。ＡｐｘⅡ毒素具有良好的免疫原性。王春来等［８］利用ＡｐｘⅡＡ的原核表达载体ｐＧＥＸ－Ａｐｘ

ⅡＡ在转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ－２１（ＤＥ３）中进行表达后，表

达产物以包涵体形式存在。同时发现包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原，用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹实验，结果表明重组的ＡｐｘⅡＡ蛋白具有良好的免疫原性，可以作为抗原用于ＥＬＩＳＡ诊断。

３ＡｐｘⅢ毒素

ＡｐｘⅢ毒素是一种分子量较大的蛋白，为１２０

ｋＤａ。该毒素没有溶血活性，但是它对肺泡巨噬细

胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。在１５个血清型中，血清型２、３、４、６、８、１１产生ＡｐｘⅢ。ＡｐｘⅢ操纵子是由激活基因ＡｐｘⅢＣ、结构基因Ａｐｘ

ⅢＡ和两个分泌基因ＡｐｘⅢＢ和ＡｐｘⅢＤ四个基因组成的，即ＡｐｘⅢＣＡＢＤ。其中ＡｐｘＩＡ基因编码毒素的结构蛋白，在产生ＡｐｘⅢ毒素的血清型中，Ａｐｘ

ⅢＣＡＢＤ操纵子的序列很少有血清型的特异性差异。只有血清２型ＡＰＰ中ＡｐｘⅢＡ基因的Ｃ－末端

不同于其他血清型。这一差异位于甘氨酸丰富的重复区和分泌信号之间［９］。

邵美丽等［１０］以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清２型参考株基因组ＤＮＡ为模板，以ＰＣＲ方法扩增出ＡｐｘⅢＡ基因３．１ｋｂ的片段，成功构建了重组表达ｐＧＥＸ－ＡｐｘⅢＡ，转化大肠杆菌ＢＬ－２１（ＤＥ３）中并获得表达。表达的融合蛋白分子量约为１４０Ｋｕ，

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证明该融合蛋白具有免疫学活性。

４ＡｐｘＩＶ毒素

ＡｐｘＩＶ毒素是近几年在研究猪胸膜肺炎放线

杆菌分泌的毒素中发现的，它在整个致病过程中扮演着重要的角色。研究表明，所有血清型的ＡＰＰ在体内均可产生ＡｐｘＩＶ毒素。

ＡｐｘＩＶ由ＡｐｘＩＶＡ基因编码，紧接ＡｐｘＩＶＡ基

因的上游有一ＯＲＦＩ框，下游是ＬａｃＺ基因。ＯＲＦＩ基因与前３种毒素的Ｃ基因无相似性，但其表达产物在功能上却与ＡｐｘＣ相似，同样负责ＡｐｘＩＶ的

激活［１１］。重组ＡｐｘＩＶＡ的大肠杆菌质粒表达产物有微弱的溶血活性。ＡｐｘＩＶＡ基因具有种属特异性，但不存在于放线杆菌其它种属的细菌。如李氏放线杆菌（Ａ．ｌｉｇｎｉｅｒｓⅡ）、猪放线杆菌（Ａ．ｓｕｉｓ）、罗氏放线杆菌（Ａ．ｒｏｓｓⅡ）和非致病性的猪扁桃体放线杆菌（Ａ．ｐｏｒｃｉｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ）。此外，也不存在于多杀性巴氏杆菌（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）和嗜血杆菌

（Ｈ

ｅｍｏｐｉｌｕｓｓｐ．）等。不同的血清型ＡｐｘＩＶＡ毒素蛋白的分子量有微小的区别。以血清１型标准株为例，ＡｐｘＩＶＡ毒素的相对分子量为２０２ｋＤａ，有溶血活性，具有典型的ＲＴＸ蛋白毒素的特征，即Ｎ－末端疏水，Ｃ－末端含有２４个富含甘氨酸的九肽重复，可结合

Ｃａ２＋。所不同的是Ｃ－末端含有两个具有ＤＮＡ聚合

酶特征的序列。ＡｐｘＩＶＡ基因比较保守，尤其是在其３ˊ端。Ａｌａｉｎ等［１２］运用基因探针对各型的ＡＰＰ及致病机理相似的病原菌进行检测，发现ＡＰＰ所有血清型ＡｐｘＩＶＡ的３ˊ末端都存在一段４００ｂｐ以上的序列，而其它相关病原菌却没有该段序列。此外，ＤＮＡ聚合酶２明显序列在该区域重复，与九肽一起形成一个模块结构。但是其作用还不明确。通过测序和ＰＣＲ研究表明：该模块某些拷贝删除的在血清３型和血清１型以及其他血清型ＡｐｘＩ－

ＶＡ基因中肯定发生。但是，血清１型和血清３型

ＡｐｘＩＶＡ相似的溶血性和溶血作用在免疫学上是

难以区别的［１３］。

研究表明，ＡｐｘＩＶ是ＡＰＰ中特异的毒素蛋白，与ＡｐｘＩ、ＡｐｘⅡ、ＡｐｘⅢ毒素相比，ＡｐｘＩＶ毒素是ＡＰＰ中的特异性抗原，为该病的诊断提供了便利。

Ｄｒｅｙｆｕｓ等［１４］用ＡｐｘＩＶ基因的原核重组表达ＡｐｘＩＶ蛋白，利用免疫印记法检测ＡＰＰ感染情况，灵敏度

高达１００％。用该蛋白作为ＥＬＩＳＡ包被抗原，制成

ＡｐｘＩＶＥＬＩＳＡ试剂盒，可以在猪感染３周后作出检测，并且证实抗原反应在５０天后依然强烈，同时能

够鉴别疫苗毒和野毒的感染。在国内，许多学者利用ＰＣＲ技术来扩增ＡｐｘＩＶ基因的特异性片断或基因全序列，已取得了比较满意的效果。刘军发等［１５］成功扩增出约６１０ｂｐ的ＡＰＰ片段，而对照菌均没有扩增出该片段；梁金华等［１６］成功的扩增出ＡｐｘＩＶ基因，并建立了ＰＣＲ诊断方法，有较好特异性。

５展望

Ａｐｘ毒素在胸膜肺炎放线杆菌致病性中起着

研究进展

猪胸膜肺炎放线杆菌Ａｐｘ毒素的研究进展—张欣，等

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