猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素的研究进展

猪胸膜肺炎放线杆菌Ａｐｘ毒素的研究进展
张欣，马魁，罗满林
（华南农业大学兽医学院，广东广州
５１０６４２）
收稿日期：２００６－０５－１７
ＡＰＰ是引起猪传染性胸膜肺炎的致病菌。

该
菌为革兰氏阴性，有荚膜的短小球杆菌。

根据其生长营养需要，可将该菌分为两个生物型，即生物Ⅰ型（Ｎ
ＡＤ依赖型）和生物Ⅱ型（ＮＡＤ非依赖型）。

迄今所知ＡＰＰ共有１５个血清型，即１～１５型，其中
５型又分为５ａ和５ｂ亚型。

由于部分血清型菌株
的脂多糖具有相同的Ｏ侧链，因而存在部分抗原交叉反应，如血清１／９／１１、４／７、５／６。

不同的血清型致病性有所不同，可能与其毒力有关。

其中血清
１、５、９和１１四种血清型毒力最强，而血清３和６
型则被认为毒力较弱。

在ＡＰＰ致病机制中有多个因子的参与，包括荚膜多糖、脂多糖（ＬＰＳ）、外膜蛋
白、转铁结合蛋白、蛋白酶、渗透因子及Ａｐｘ毒素。

其中Ａｐｘ毒素是主要的毒力因子，也是主要的免疫原［１］，因此有关Ａｐｘ毒素的研究已成为该病的研究热点。

Ａｐｘ毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌分泌的一类
溶血毒素。

血清型毒力的强弱与Ａｐｘ毒素种类有关。

ＡＰＰ的１５个血清型共产生四种溶血毒素［２］：Ａｐｘ
Ⅰ、ＡｐｘⅡ、ＡｐｘⅢ、ＡｐｘⅣ。

它们都属于ＲＴＸ毒素
（ｒｅｐｅａｔｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏｘｉｎ，ＲＴＸ）家族。

四种
毒素都具有ＣＡＭＰ效应，即与金黄色葡萄球菌共培养时，其溶血效应会加强［３］。

其中产ＡｐｘⅠ和ＡｐｘⅡ毒素的血清型毒力最强。

在ＡＰＰ的致病过程中Ａｐｘ毒素的作用是溶解红细胞，但是它还具有调节白细胞活性的功能。

这对于它在猪传染性胸膜肺炎致病过程中尤为重要。

１ＡｐｘⅠ毒素
在ＡＰＰ感染过程中，会产生有活性的毒素
ＡｐｘＩ。

ＡｐｘＩ毒素具有很强的溶血活性。

其相对分
子量为１０５ｋＤａ，同时它对肺泡巨噬细胞和嗜中
性白血球也具有很强的细胞毒性作用。

研究表明血清型１、５、９、１０、１１产生ＡｐｘＩ。

ＡｐｘＩ操纵子是由激活基因ＡｐｘＩＣ、结构毒素基因ＡｐｘＩＡ、分泌必需基因ＡｐｘＩＢ和ＡｐｘＩＤ四个基因组成的，即ＡｐｘＩ－ＣＡＢＤ。

这是一个典型的ＲＴＸ毒素的操纵子。

在操纵子中，各基因的功能不同。

ＡｐｘＩＡ基因编码毒素蛋白的前体，ＡｐｘＩＣ基因编码毒素翻译后的激活物，
ＡｐｘＩＢＤ基因负责毒素的分泌。

ＡｐｘＩ操纵子被转录
成两种ＲＮＡ：一种大小为３．５ｋｂ，由Ｃａ２＋诱导，含有ＡｐｘＩＣ和ＡｐｘＩＡ的ＲＮＡ，它占主要地位；另一种
大小为７．５ｋｂ，不是由Ｃａ２＋诱导，它包含整个操
纵子ＡｐｘＩＣＡＢＤ的ＲＮＡ［４］。

在不同的血清型中，可能存在ＡｐｘＩ毒素基因的同源性。

Ｆｒｅｙ利用克隆以及限制性酶切分析了
１、９和１１型的ＡｐｘＩ毒素基因的同源性。

发现三
者的同源性很高，但是这三种血清型与血清５ａ、
５ｂ、１０、１１型的ＡｐｘＩ基因存在明显的差异。

虽然
这两组基因在限制性酶切片段上的差异已达到了
５％，但是它们所表达的两组毒素的结构非常相似。

到目前为止，还没有单克隆抗体能够将它们区分开来［５］。

严克霞等［６］利用毒性极强的ＡＰＰ２１菌株表达的ＡｐｘＩＡ毒素，并且与天然毒素做了免疫原性比较。

结果表明，天然毒素和复性的重组表达蛋白均具有良好的免疫原性，对小鼠具有较好的免疫保护效力。

２ＡｐｘⅡ毒素
ＡｐｘⅡ有较弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞
摘要：猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）引起的细菌性呼吸道传染病。

Ａｐｘ毒素（ａｃｔｉｎｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｔｏｘｉｎ）是由胸膜肺炎放线杆菌分泌的一类溶血毒素，在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中，Ａｐｘ毒素起了重要的作用。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌；Ａｐｘ毒素
中图分类号：Ｓ８５２．６１＋９
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５－８５６７（２００６）０５－００１５－０３
广东畜牧兽医科技２００６年（第３１卷）第５期研究进展
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和嗜中性白血球也具有细胞毒性作用。

其分子量为１０３ｋＤａ。

除血清型１０和１４外，其他血清型都分泌ＡｐｘⅡ毒素。

已经证实ＡｐｘⅡ操纵子仅包含激活基因ＡｐｘⅡＣ和结构蛋白基因ＡｐｘⅡＡ，但没有分泌蛋白Ｂ和Ｄ基因。

其实，在ＡｐｘⅡ基因中，还存在短截的ＡｐｘⅡＢＤ的操纵子。

正是ＡｐｘⅡＢＤ操纵子的存在，在ＡｐｘⅡＡ的分泌过程中起到了反式互补的作用［７］。

ＡｐｘⅡ毒素具有良好的免疫原性。

王春来等［８］利用ＡｐｘⅡＡ的原核表达载体ｐＧＥＸ－Ａｐｘ
ⅡＡ在转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ－２１（ＤＥ３）中进行表达后，表
达产物以包涵体形式存在。

同时发现包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原，用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹实验，结果表明重组的ＡｐｘⅡＡ蛋白具有良好的免疫原性，可以作为抗原用于ＥＬＩＳＡ诊断。

３ＡｐｘⅢ毒素
ＡｐｘⅢ毒素是一种分子量较大的蛋白，为１２０
ｋＤａ。

该毒素没有溶血活性，但是它对肺泡巨噬细
胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。

在１５个血清型中，血清型２、３、４、６、８、１１产生ＡｐｘⅢ。

ＡｐｘⅢ操纵子是由激活基因ＡｐｘⅢＣ、结构基因Ａｐｘ
ⅢＡ和两个分泌基因ＡｐｘⅢＢ和ＡｐｘⅢＤ四个基因组成的，即ＡｐｘⅢＣＡＢＤ。

其中ＡｐｘＩＡ基因编码毒素的结构蛋白，在产生ＡｐｘⅢ毒素的血清型中，Ａｐｘ
ⅢＣＡＢＤ操纵子的序列很少有血清型的特异性差异。

只有血清２型ＡＰＰ中ＡｐｘⅢＡ基因的Ｃ－末端
不同于其他血清型。

这一差异位于甘氨酸丰富的重复区和分泌信号之间［９］。

邵美丽等［１０］以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清２型参考株基因组ＤＮＡ为模板，以ＰＣＲ方法扩增出ＡｐｘⅢＡ基因３．１ｋｂ的片段，成功构建了重组表达ｐＧＥＸ－ＡｐｘⅢＡ，转化大肠杆菌ＢＬ－２１（ＤＥ３）中并获得表达。

表达的融合蛋白分子量约为１４０Ｋｕ，
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证明该融合蛋白具有免疫学活性。

４ＡｐｘＩＶ毒素
ＡｐｘＩＶ毒素是近几年在研究猪胸膜肺炎放线
杆菌分泌的毒素中发现的，它在整个致病过程中扮演着重要的角色。

研究表明，所有血清型的ＡＰＰ在体内均可产生ＡｐｘＩＶ毒素。

ＡｐｘＩＶ由ＡｐｘＩＶＡ基因编码，紧接ＡｐｘＩＶＡ基
因的上游有一ＯＲＦＩ框，下游是ＬａｃＺ基因。

ＯＲＦＩ基因与前３种毒素的Ｃ基因无相似性，但其表达产物在功能上却与ＡｐｘＣ相似，同样负责ＡｐｘＩＶ的
激活［１１］。

重组ＡｐｘＩＶＡ的大肠杆菌质粒表达产物有微弱的溶血活性。

ＡｐｘＩＶＡ基因具有种属特异性，但不存在于放线杆菌其它种属的细菌。

如李氏放线杆菌（Ａ．ｌｉｇｎｉｅｒｓⅡ）、猪放线杆菌（Ａ．ｓｕｉｓ）、罗氏放线杆菌（Ａ．ｒｏｓｓⅡ）和非致病性的猪扁桃体放线杆菌（Ａ．ｐｏｒｃｉｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ）。

此外，也不存在于多杀性巴氏杆菌（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）和嗜血杆菌
（Ｈ
ｅｍｏｐｉｌｕｓｓｐ．）等。

不同的血清型ＡｐｘＩＶＡ毒素蛋白的分子量有微小的区别。

以血清１型标准株为例，ＡｐｘＩＶＡ毒素的相对分子量为２０２ｋＤａ，有溶血活性，具有典型的ＲＴＸ蛋白毒素的特征，即Ｎ－末端疏水，Ｃ－末端含有２４个富含甘氨酸的九肽重复，可结合
Ｃａ２＋。

所不同的是Ｃ－末端含有两个具有ＤＮＡ聚合
酶特征的序列。

ＡｐｘＩＶＡ基因比较保守，尤其是在其３ˊ端。

Ａｌａｉｎ等［１２］运用基因探针对各型的ＡＰＰ及致病机理相似的病原菌进行检测，发现ＡＰＰ所有血清型ＡｐｘＩＶＡ的３ˊ末端都存在一段４００ｂｐ以上的序列，而其它相关病原菌却没有该段序列。

此外，ＤＮＡ聚合酶２明显序列在该区域重复，与九肽一起形成一个模块结构。

但是其作用还不明确。

通过测序和ＰＣＲ研究表明：该模块某些拷贝删除的在血清３型和血清１型以及其他血清型ＡｐｘＩ－
ＶＡ基因中肯定发生。

但是，血清１型和血清３型
ＡｐｘＩＶＡ相似的溶血性和溶血作用在免疫学上是
难以区别的［１３］。

研究表明，ＡｐｘＩＶ是ＡＰＰ中特异的毒素蛋白，与ＡｐｘＩ、ＡｐｘⅡ、ＡｐｘⅢ毒素相比，ＡｐｘＩＶ毒素是ＡＰＰ中的特异性抗原，为该病的诊断提供了便利。

Ｄｒｅｙｆｕｓ等［１４］用ＡｐｘＩＶ基因的原核重组表达ＡｐｘＩＶ蛋白，利用免疫印记法检测ＡＰＰ感染情况，灵敏度
高达１００％。

用该蛋白作为ＥＬＩＳＡ包被抗原，制成
ＡｐｘＩＶＥＬＩＳＡ试剂盒，可以在猪感染３周后作出检测，并且证实抗原反应在５０天后依然强烈，同时能
够鉴别疫苗毒和野毒的感染。

在国内，许多学者利用ＰＣＲ技术来扩增ＡｐｘＩＶ基因的特异性片断或基因全序列，已取得了比较满意的效果。

刘军发等［１５］成功扩增出约６１０ｂｐ的ＡＰＰ片段，而对照菌均没有扩增出该片段；梁金华等［１６］成功的扩增出ＡｐｘＩＶ基因，并建立了ＰＣＲ诊断方法，有较好特异性。

５展望
Ａｐｘ毒素在胸膜肺炎放线杆菌致病性中起着
研究进展
猪胸膜肺炎放线杆菌Ａｐｘ毒素的研究进展—张欣，等
１６・・
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选购兽药要“三看”
一看包装。

从外包装看，合格兽药生产厂生产的兽药，带有“Ｒ”注册商标，标有“兽用”字样和兽药ＧＭＰ证字，并有省级以上兽药药政管理部门核发的产品生产批准文号，明确标示产品的主要成分、含量、作用与用途、用法与用量、生产日期和有效期等内容。

从产品本身外观看，水剂、针剂应无杂质，无沉淀和无结晶析出，溶液澄清，透明度好。

不合格者，置于强光下观察，可见有微小颗粒或絮状物、杂质等。

片剂、散剂应色泽均匀，无花斑，无吸潮霉变现象。

不合格者，包装粗糙，手触压片不紧，上有粉末附着，无防潮避光保护等。

二看企业。

正规和信誉度较好的兽药生产企业生产检测设备和手段相对先进，兽药质量比较稳定。

相反，有的厂家生产设备陈旧，生产工艺简陋，检测手段不健全，产品质量难以保证。

因此，在选购兽药时不能只图便宜而不顾质量，要注意观察兽药包装上有无该药品的生产批准文号、厂家地址、生产日期、使用说明及有效期或保质期等内容。

如果以上这些内容不全或不规范，则说明该兽药质量值得怀疑，最好不要购买。

三看说明。

要了解兽药主要品种的有效成分、作用及注意事项，同一类兽药有多个不同的品名，购买时要了解该产品的主要成分及含量，掌握其作用，按照其说明进行选购使用，尽量避免因过量使用兽药造成药物浪费或畜禽中毒，量小达不到治疗效果的现象。

（资料来源：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｎａ－ａｈ．ｃｏｍ）
重要作用，但是我国目前还没有一种检测方法能快速、有效的检测出胸膜肺炎放线杆菌。

Ａｐｘ毒素作为一种很好的免疫原和毒素因子，国外已经开发出包含Ａｐｘ毒素的灭活疫苗和亚单位疫苗。

与国外相比，我们的ＡＰＰ疫苗种类比较单一，并且大多数是自家苗或者是针对某种单一血清型的疫苗。

虽然有多价疫苗，但是保护效果不太理想。

今后，应通过对Ａｐｘ毒素的研究，尤其是对毒素的基因和蛋白的研究，有效地利用Ａｐｘ毒素的毒力特性以及血清型之间的保护作用，研制含有
Ａｐｘ毒素的灭活疫苗或亚单位疫苗。

参考文献：
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研究进展
猪胸膜肺炎放线杆菌Ａｐｘ毒素的研究进展—张欣，等
１７・・。