Ⅰ群禽腺病毒血清4型的分离鉴定及不同代次细胞毒的序列分析

Ⅰ群禽腺病毒血清4型的分离鉴定及不同代次细胞毒的序列分

析

禽腺病毒（Fowl Adenovirus,FAdV）属于腺病毒科、禽腺病毒属。以限制性酶切图谱以及血清学交叉中和反应性为依据,目前FAdV可以分成5个种（A-E）,12个血清型（血清型1-7,8a、8b、9-11）。流行病学的研究发现,FAdV广泛分布于世界范围内,并易感于不同日龄的家禽。

其中,Ⅰ群血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus serotype 4,FAdV-4）主要能引起鸡的“心包积液-肝炎综合征”（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）,该病最早于1963年在美国被发现,随后便流行至全球各个国家。自2013年起,我国的多个省份也相继爆发由FAdV-4感染所引起的HHS,对国内鸡类养殖造成了严重的经济损失。为了解FAdV-4在山东省的流行情况及其演变进化规律,本研究对自山东多个鸡场分离到的FAdV-4毒株开展了相关研究,主要内容如下:1.FAdV-4的分离鉴定和全基因组测序分析本研究收集了山东省内不同

来源的19份疑似感染FAdV-4病鸡的肝脏,首先通过聚合酶链式反应（PCR）扩增Hexon基因,并对扩增产物进行测序分析。

测序结果显示,19份病料均可检测到FAdV-4的存在。随后,选取其中一份病料,研磨过滤后通过卵黄囊途径接种SPF鸡胚,分离到一株Ⅰ群血清4型禽腺病毒并将其命名为SDTA1512株。通过不同引物的设计对不同基因区域进行了扩增和克隆测序,对得到的基因片段进行拼接获得了其全基因组。

将该序列与不同参考毒株进行序列对比,结果显示本次分离株与HB1510和JSJ13全基因组同源性最高,而与其它国家分离株同源性较低。最后,将分离株SDTA1512通过腹腔接种1日龄SPF雏鸡,同时设对照组,研究了该病毒的致病性。

结果显示,攻毒组鸡只在接种病毒后,出现精神沉郁,翅膀下垂,羽毛蓬乱等临床

症状。

攻毒后第2天开始出现死亡,4天内死亡率达到100%。解剖发病鸡,可见心包中蓄积大量黄色液体;肝脏黄染,有的出现明显的出血点;肾脏肿大出血,有尿酸

盐沉积;个别鸡肌胃肿大。试验组鸡剖解均正常,未发现病变。

动物实验表明,本研究所分离到的SDTA1512株具有较强的致病性。2.FAdV-4 SDTA1512株在鸡胚原代肾细胞（CEK）中增殖规律的研究为了研究FAdV-4

SDTA1512株在鸡胚原代肾细胞（CEK）中的增殖规律,本试验首先建立了检测FAdV-4 Hexon基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示,本研究所建立的荧光定量PCR方法溶解曲线均呈单峰,无引物二聚体及其他非特异性扩增产物,标准曲线和Ct值之间呈线性关系,线性回归曲线相关系数（R²）为0.999,特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性好,为研究病毒增殖动态奠定了基础。

随后,将10⁴ TCID₅₀的SDTA1512株接种于CEK细胞,观察接毒后第6、12、24、36、48、72、96 h的细胞形态,同时收集细胞样品提取DNA,通过所建立的荧光定量PCR方法研究病毒的增殖动态。结果显

示,SDTA1512株可以在CEK细胞中良好增殖并达到较高滴度。当初始感染量为

10⁴TCID₅₀时,48 h细胞即出现明显的病变,细胞变大变圆、逐渐变得紧凑、出现蚀斑、最终死亡脱落。

荧光定量PCR结果显示,接种病毒12 h后病毒即大量增殖,到第48 h达到高峰,之后病毒总量逐渐保持不变。该研究为FAdV-4的体外传代提供了科学数据和支持。3.FAdV-4体外传代及不同代次病毒基因序列变异分析将本实验室分离的FAdV-4 SDTA1512株在CEK细胞上进行连续传代,传至25代,每一代均留存病毒

和感染的CEK细胞样本。

选取第5、10、15、20、25代病毒,提取其病毒DNA,通过PCR扩增其Hexon 基因、Penton基因、Fiber 1基因和Fiber 2基因。对扩增序列进行测序、分析。结果显示,在传代过程中,Penton基因和Fiber 2基因十分稳定,Hexon基因和Fiber 1基因则发生了突变。

这些突变与病毒致弱的关系,有待进一步验证。