HOCHEST_染色

H o e c h s t染色的讨论

H o e c h s t染色的具体步骤

caspase8428：我看到资料上说，荧光染色的时候可以用DAB与荧光物质反应生成沉淀。那么，Hoechst染色时，什么时候加DAB，浓度是多少，用什么稀释，最后怎么来终止反应？是不是还要用抗退色固片介质来封片？

sunandsuny：Hoechst染色时无需用DAB来显色，它直接结合细胞的DNA ，经过紫外光激发后发出蓝色荧光。如果你是用来染培养的细胞的话，可以参考下面的步骤（切片雷同）：

细胞涂片：甲醇：冰乙酸（3：1）固定15分钟，PBS洗一次，加Hoechest 33258荧光染料37℃孵育15~30分钟，于荧光显微镜下观察。凋亡细胞由于染色质固缩，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。操作比较容易的。

altbenair:想做肝癌细胞hepG2。看过很多帖子还有文献上的方法，但是都不太具体

大都是这样：固定（福尔马林4%），pbs洗三遍，加hoechst孵育1H，将细胞悬液滴于载玻片上荧光显微镜检测。细胞悬液怎么做？我要做贴壁细胞用胰酶消化？

drake015: .

1．贴壁细胞，让细胞自己在盖玻片上爬片。操作如下：

A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS 或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。

E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

2.悬浮细胞

A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。

F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

3.组织切片

A. 常规包埋切片后，脱腊，透明。

B. PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。

C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。

D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

E. 将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

ylcui:

产品简介：碧云天生产的细胞凋亡－Hoechst染色试剂盒为您提供了一种快速简便的细胞凋亡检测方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst染色时，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，参见本页照片（贴壁细胞）。

1、只需25分钟即可完成细胞凋亡检测。

2、本试剂盒提供了固定液，染色液，及抗荧光淬灭封片液。

3、对贴壁细胞，悬浮细胞和组织切片均适用。

4、足够检测100个样品。

包装清单：

固定液50 ml

Hoechst 33258染色液50 ml

抗荧光淬灭封片液 5 ml

说明书 1 份

保存条件：4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效。

注意事项：1、需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

2、需PBS或0.9%NaCl溶液。

3、需盖玻片与载玻片。

4、荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

5、在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。

使用说明：

1.贴壁细胞

A.取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B.刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C.去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D.加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。

E.用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

F.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

G.荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。

2.悬浮细胞

A.离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长