结肠癌组织中干细胞分子标志物LGR5的检测
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结肠癌组织中干细胞分子标志物LGR5的检测
包卫光;陈瑜
【摘要】目的探讨富含亮氨酸重复单位的G蛋白耦联受体5(LGR5)在人结肠癌中的表达情况及其与临床病理参数的关系.方法利用自主研发的一次成型组织芯片制作技术制作结肠癌组织芯片,用免疫组织化学染色(免疫组化)法检测246例结肠癌组织LGR5的表达,分析其与临床病理因素及预后的相关性.结果 LGR5在结肠癌远端正常对照组织、癌旁组织和癌灶组织中的表达率分别为8.7%、45.5%和44.7%(x2=183.1,P<0.01);LGR5的阳性表达与组织分化程度相关(P <0.01);67例已死亡病例中LGR5表达阳性和阴性患者生存期分析无显著性差异(x2=0.785,p>0.05).结论 LGR5与结肠癌的组织分化程度相关,可能作为结肠癌早期筛查和后期靶向治疗的分子标志物.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2012(030)009
【总页数】3页(P691-693)
【关键词】结肠癌;干细胞;富含亮氨酸重复单位的G蛋白耦联受体5;组织芯片【作者】包卫光;陈瑜
【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省台州医院组织样本库,浙江临海317000;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003【正文语种】中文
【中图分类】R735.3+5
富含亮氨酸重复单位的G蛋白耦联受体5(LGR5),是一种干细胞分子标志物,也
是Wnt信号通路的靶基因之一,其表达量的增加能够促进胃肠黏膜的自我更新[1]。LGR5在卵巢癌、基底细胞癌及食管腺癌等恶性肿瘤组织中也有表达[2-4],但目前对LGR5在癌变发生、发展过程中的作用和机制还知之甚少[5]。
肿瘤干细胞理论认为,肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展和转移的根源[6-7]。作为干细胞的分子标志物,LGR5在各种恶性肿瘤中的阳性表达在一定程度上支持了这一理论。肿瘤干细胞的存在也可能是放、化疗等肿瘤治疗手段失败的原因所在[8]。因此,进一步研究LGR5在各种恶性肿瘤中的表达及其作用机制非常必要。本研究旨在利用自主研发的一次成型组织芯片制作技术制作结肠癌组织芯片,并用免疫组化法检测LGR5在结肠癌中的表达及其与临床病理参数的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象选取2005年至2011年浙江省台州医院组织标本库收集的246例石蜡包埋的结肠癌组织样本,其中男131例,女115例;年龄26~90岁,平均63.0岁。包括与癌灶组织(C)相配对的远端正常对照组织(N,距癌灶5 cm以上的肠黏膜)242例和癌旁组织(P,癌灶周边的肠黏膜)99例。其中带有随访资料并已死亡
病例67例。
1.2 主要试剂与仪器兔抗人LGR5抗体(Abcam公司),即用型鼠、兔联用二抗、DAB显色液(Dako公司),RM2235组织切片机、DM 2000光学显微镜(Leica公司);DHP-9052电热恒温培养箱(上海一恒公司);一次成型组织芯片制作模具(自主设计)。
1.3 方法
1.3.1 组织芯片的制作根据自主研发的一次成型组织芯片制作技术制作芯片蜡块。步骤:常规方法进行切片、染色、定位、取芯后,按N、P、C配对将获得的组织
芯依次排入铜质模具(图1)的7×9阵列模腔(6)内,每例设2个重复点,放入70℃烤箱内烤20 min(蜡芯表面微融化),取出后马上注入70℃的石蜡,然后取出垫片(3),均匀用力按下阵列孔铜板(1)将组织芯顶起。在承蜡槽(5)上放入包埋盒并加满石蜡,最后将模具放在冷空调口快速冷却。
图1 一次成型组织芯片制作模具示意图
1.3.2 免疫组织化学染色将芯片蜡块切成4 μm厚的切片。二甲苯、梯度酒精脱蜡后0.3%H2O2浸泡20 min,枸橼酸(pH 6.0)高压修复,加兔抗人LGR5抗体(1∶20)37℃温育1 h,加入即用型鼠、兔联用二抗37℃温育30 min,DAB显色1.5 min,苏木素复染1 min,酒精脱水封片。以PBS代替一抗作空白对照,正常胃黏膜组织作阴性对照,预实验中确认的阳性表达组织作阳性对照。结果判断:LGR5阳性染色呈棕黄(黑)色,定位在胞质。高倍镜下每张切片随机选择5个视野,每个视野计数200个目的细胞,共1000个。计算阳性肿瘤细胞所占的百分数。
肿瘤细胞无着色或阳性率<5%为(-),6% ~25%的细胞着色为(+),26% ~50%的细胞着色为(2+),>50%的细胞着色为(3+)。所有切片均经两位病理科医师按
双盲原则做出判断。
1.4 统计学分析用SPSS 17.0统计软件进行。免疫组织化学及与临床病理资料分
析用χ2检验,生存率用Kaplan-Meier法分析,组间差异比较用Log rank检验,以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 LGR5在组织中的表达 LGR5阳性染色位于胞质,多靠近胞核,呈颗粒状(图2)。LGR5在远端正常黏膜(N)、癌旁黏膜(P)和癌灶(C)中的表达强度构成比差异显著(P<0.01);N、C组及N、P组间LGR5表达率有显著性差异(P<0.01);P、C组
间无显著差异(χ2=0.016,P >0.05)。见表1。
图2 LGR5在结肠癌组织中的表达(×400)注:A、C、E分别为LGR5在正常结肠、
癌旁、癌组织中阴性表达;B、D、F分别为LGR5在正常结肠、癌旁、癌组织中阳
性表达。
表1 LGR5在结肠癌组织中的表达远端肠黏膜(N) 242 221 11 6 4 21(8.7)
2.2 LGR5与临床病理资料分析结果 LGR5在结肠癌组织中的阳性表达与肿瘤分化
程度相关(P<0.05),但与性别、年龄、TNM分期及有无远处转移无关(P >0.05),见表2。
2.3 LGR5与患者生存期之间的关系 Kaplan-Meier法分析67例已死亡病例LGR5表达阳性组和阴性组之间的生存期,未见明显统计学差异(χ2=0.785,P >0.05),见图3。
表2 结肠癌LGR5阳性表达与临床病理参数之间的关系
图3 67例死亡病例生存期曲线
3 讨论
LGR5在结肠癌组织中的阳性表达率(44.7%)明显高于远端正常对照组织(8.7%),
说明LGR5与结肠癌的发生、发展相关。作为干细胞的分子标志物,LGR5在结肠癌中的高表达说明结肠癌的发生可能与肿瘤干细胞有关。本研究中,99例配对的
癌旁组织中有45例(45.5%)LGR5表达阳性,其阳性率明显高于远端正常黏膜组织,却与癌组织几乎相同,说明LGR5在结肠癌形成之前或癌变早期就已发挥作用。LGR5可能在癌症形成之前就已在结肠黏膜干细胞中表达增加,引导肠黏膜的快速更新,也可能与结肠癌肿瘤干细胞的形成有关,所以LGR5有望成为结肠癌早期筛查和诊断的参考指标。对结肠镜活检标本作LGR5检测并结合后期随访进行分析将有利于此推测的验证。
本研究中,67例有随访资料并已死亡样本中6例为低分化或未分化结肠癌,其平
均生存期为8.8月,明显低于其他61例中、高分化组的20.0月(P<0.05),可见
低分化程度能够负面影响预后。但LGR5在低、未分化组癌组织中的阳性表达率明