生物技术制药第三章 基因工程制药PPT教学课件
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cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。
Biblioteka Baidu
第三节 目的基因的获得
一、逆转录法 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA
（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩 大药物筛选来源。
基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原 核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很 多行业中都会有重要的应用。
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载 体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或 细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基 因在工程菌内进行复制和表达的技术。
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
培养工程菌
成品检定 包装
基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程 菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主 要在实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞） 的大规模培养一直到产品的分离纯化、 质量控制等。
工程菌（或细胞）构建中重要的工具
该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶 是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并 转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞）大量复制目的基 因过程中的重要工具。
另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于 真核基因的内含子及基因的后翻译过程，所以真 核系统得到了相应发展。
第三节 目的基因的获得
目前克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录 成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某 种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真 核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用 下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一 链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚 合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该 多肽的双链DNA序列。
DNA多聚酶I Klenow片段
逆转录酶
ds-cDNA
ds-cDNA
1、mRNA的纯化
分离纯化目的基因的mRNA是极其困难的，细胞 内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总 量的2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由 几百到几千个核苷酸组成。
在真核细胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚 腺苷酸polyA组成的末端，长达20~250个腺苷酸， 可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓度盐 溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液 和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较 纯的mRNA。
基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克 隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌 构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物 的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个 阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将 会随研究和生产条件的不同而改变。
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因
组建重组质粒 构建基因工程 菌或细胞
工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸 发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析， 对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高 效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离 纯化、质量控制、产品保存等技术。
第三节 目的基因的获得
对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采 取适当的方法。
对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行 分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA 中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的， 因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。
（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便 对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩 大这些物质的应用范围；
（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的 内源性生理活性物质；
利用基因工程技术生产药品的优点：
（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存 在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进 行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱 氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导 致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨 酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高；
应用基因工程技术可十分方便且有效地解 决上述提到的问题，从量、质上都可以得 到改进，且可以创造全新物质。
如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以 及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可 通过基因工程技术获得。
利用基因工程技术生产药品的优点：
（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等）， 为临床使用提供有效的保障；
同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限 制性内切酶和核苷酸序列分析。
基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物 和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要 考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表 达量的多少和分离纯化的难易。
下游阶段在产业化中是极其重要的
下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要 包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生 物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发， 分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术， 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电 子计算机的优化控制等。
第三讲 基因工程制药
第三讲 基因工程制药
第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例
第一节 概述
生物技术的核心就是基因工程，基因工 程技术最成功的应用就是用于生物治疗 的新型生物药物的研制。
传统生物药物由于来源及制备上的困难、 价格等因素的影响，此外在制备过程可 能受到的病毒、衣原体、支原体等的感 染等问题，促使人们寻求安全、实用、 疗效可靠的新方法来制备生物药物。
基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物 制备上的优势。
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第三节 目的基因的获得
一、逆转录法 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA
（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩 大药物筛选来源。
基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原 核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很 多行业中都会有重要的应用。
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载 体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或 细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基 因在工程菌内进行复制和表达的技术。
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
培养工程菌
成品检定 包装
基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程 菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主 要在实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞） 的大规模培养一直到产品的分离纯化、 质量控制等。
工程菌（或细胞）构建中重要的工具
该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶 是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并 转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞）大量复制目的基 因过程中的重要工具。
另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于 真核基因的内含子及基因的后翻译过程，所以真 核系统得到了相应发展。
第三节 目的基因的获得
目前克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录 成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某 种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真 核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用 下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一 链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚 合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该 多肽的双链DNA序列。
DNA多聚酶I Klenow片段
逆转录酶
ds-cDNA
ds-cDNA
1、mRNA的纯化
分离纯化目的基因的mRNA是极其困难的，细胞 内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总 量的2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由 几百到几千个核苷酸组成。
在真核细胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚 腺苷酸polyA组成的末端，长达20~250个腺苷酸， 可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓度盐 溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液 和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较 纯的mRNA。
基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克 隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌 构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物 的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个 阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将 会随研究和生产条件的不同而改变。
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因
组建重组质粒 构建基因工程 菌或细胞
工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸 发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析， 对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高 效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离 纯化、质量控制、产品保存等技术。
第三节 目的基因的获得
对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采 取适当的方法。
对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行 分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA 中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的， 因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。
（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便 对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩 大这些物质的应用范围；
（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的 内源性生理活性物质；
利用基因工程技术生产药品的优点：
（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存 在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进 行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱 氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导 致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨 酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高；
应用基因工程技术可十分方便且有效地解 决上述提到的问题，从量、质上都可以得 到改进，且可以创造全新物质。
如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以 及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可 通过基因工程技术获得。
利用基因工程技术生产药品的优点：
（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等）， 为临床使用提供有效的保障；
同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限 制性内切酶和核苷酸序列分析。
基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物 和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要 考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表 达量的多少和分离纯化的难易。
下游阶段在产业化中是极其重要的
下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要 包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生 物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发， 分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术， 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电 子计算机的优化控制等。
第三讲 基因工程制药
第三讲 基因工程制药
第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例
第一节 概述
生物技术的核心就是基因工程，基因工 程技术最成功的应用就是用于生物治疗 的新型生物药物的研制。
传统生物药物由于来源及制备上的困难、 价格等因素的影响，此外在制备过程可 能受到的病毒、衣原体、支原体等的感 染等问题，促使人们寻求安全、实用、 疗效可靠的新方法来制备生物药物。
基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物 制备上的优势。