成纤维细胞衰老研究进展

成纤维细胞衰老的研究进展
王文浩胡火珍
四川大学生命科学院
摘要：皮肤是人体最大的器官，是机体最外观的表现，而随着人们生活水平的提高，人们对于皮肤抗衰老的意识较前增强，因此皮肤抗衰老的研究已经成为时代的热点。

皮肤是由三部分组成：表皮层，真皮层以及角质层组成，而表皮层和真皮层是由结缔组织细胞—成纤维细胞构成。

所以成纤维细胞的衰老会使表皮和真皮的功能紊乱从而导致了色斑以及皱纹的产生。

目前的研究已经表明，成纤维细胞的老化，其特征在于作为损失的稳定性和生理完整性和增加细胞损伤死亡并且细胞的老化至少在某些方面是被调控的。

一般来说，我们将细胞损伤导致细胞增殖能力下降作为细胞衰老的依据。

对于成纤维细胞的衰老，其不仅受到了遗传学调控如一些衰老相关特定基因的调控，也受表观遗传学调控。

在这篇综述中，我们总结了之前对于成纤维细胞衰老的研究和可能的衰老机制以及对抗衰老的展望。

关键词：成纤维细胞；衰老；皮肤老化
Research progress of fibroblasts’ aging mechanisms Abstract: Skin consist of three parts:epidermis dermal and hypodermic.And the dermal and hypodermic is composed of syndesm cells—fibroblasts .Fibroblasts’ senescence will cause dysfunction of dermal and hypodermic which may contribute to wrinkles and chloasma’s appearance on the surface of skins.Current study has suggested that fibroblasts’ aging is characterized as loss of stability and physiological integrity and increase cell damage to
death.Over recent years,aging research showed that aging is a controlled progress—at least in some aspects. Generally,we consider cellular senescence as disabled proliferation due to cellular damage.As for fibroblast,we emphasis not just on intracellular such as genomic
instability,epigenetic alteration,and also on its function such as collagen secretion. In this review we conclude several candidate mechanism of fibroblasts’ aging and prospect of some classic or evolutionary way to anti-aging.
key words : Fibroblasts,anti-aging,senescence,skin’s aging
引言
从古代开始，长寿一直是人们不断追求的一个目标。

人类衰老的异质性和寿命周期[1]的差异说明衰老过程是基因和环境因素共同作用的结果。

细胞衰老是细胞周期重要的一个阶段。

生物学家将衰老定义为年龄相关的或年龄渐进的内在生理功能下降,导致与年龄相关的死亡率的增加和年龄相关生殖再生率的下降.细胞衰老则是年龄相关的细胞固有功能的丧失,如细胞分裂复制、细胞内和细胞间的运输及通讯功能丧失,最后导致衰老的细胞死亡或被其他细胞清除。

在细胞的生长过程中，积累的有害物质增多比如活性氧浓度导致细胞受损，从而激活相应的细胞信号通路，使细胞周期停滞或者诱导细胞凋亡。

所以在衰老的过程中，一些蛋白或者特异性的基因表达可以作为检测细胞衰老的指标。

细胞衰老的研究始于第一次在秀丽隐杆线虫分离得到一个长寿的株系[2]。

大量的研究表明了许多因素可导致衰老，如紫外线光老化[3]、活性氧簇和DNA损伤[4]、炎症因子[5]诱导均可导致衰老。

最近的研究表明，成纤维细胞的老化有几个显著的特点，我们找出和分类了衰老的细胞和分子特征。

我们考虑六个可能的通常被认为是与衰老相关的或是导致衰老的特殊标记。

基因组不稳定性（Genomic Instability）
基因组不稳定性常见类型有两种，即核苷酸水平的不稳定性与染色体水平的不稳定性[6]。

核苷酸水平的不稳定性主要包括DNA 修复基因功能障碍与微卫星不稳定性 ( MSI)[7] 。

DNA 修复基因功能障碍主要是与错配修复[8]、核苷酸切除修复(NER)[9]、碱基切除修复(BER)[10] 和双链断裂修复(DSB)[10]相关的基因障碍。

微卫星是由1～5个核苷酸组成的具有高度多态性的简单串联重复序列，MSI 是这些简单重复序列的异常改变，多由 DNA 错配修复基因(hMSH2，hMLH1，hPMS2，hMSH6)失去正常修复能力引起[8]。

染色体不稳定 [9](CIN) 是指细胞在有丝分裂过程中发生的染色体数目或
结构的异常，可能是获得额外的整个或部分染色体，也可能是丢失整个或部分染色体。

DNA损伤
在细胞生长的过程中，细胞基因组不可避免的会受到来自各种内源性或者外源性的DNA损伤[10]因素的作用，比如内源性：DNA复制出错、自发水解反应以及活性氧簇ROS[11]和外源性：生物、物理、化学试剂的影响。

细胞衰老假说之一认为DNA损伤修复与监测相关功能发生退化导致DNA损伤积累从而加速了细胞的衰老[12]。

基因组是携带有控制细胞生长、分化、发育等重要生命信息的生物高分子。

维持基因组结构、功能的相对稳定是物种得以生存、延续的前提与保障。

DNA是一重要的分子，它编码有关细胞结构和功能的重要信息。

其作用的不可替代性也使得它是衰老变化的重要靶标[13]。

近年来大量的证据表明DNA 损伤是细胞复制性衰老和细胞过早老化的一个共同介质[14]。

衰老的 DNA损伤理论[15]认为，随增龄而发生的机体功能下降的主要原因是 DNA 损伤累积和由此而造成的细胞结构、功能变化和组织动态平衡的破坏。

因此有一个共识就是渐进的和不可逆的 DNA 损伤累积造成机体功能损害，增加发病率，从而影响衰老的过程。

端粒DNA损伤
端粒[16]位于真核细胞染色体末端，对于染色体的完整性和稳定性都非常重要。

端粒缩短是引起基因组不稳定的重要原因，是衰老的生物标记。

染色体天然末端就如两顶帽子一样盖在线形 DNA 的末端，虽然不含功能基因，但具有维持染色体稳定性和基因组完整性的功能。

染色体不完整的细胞容易激活旁路导致细胞周期停滞或死亡。

研究人员发现，正常情况下，端粒在端粒结合蛋白的连接下而成“端环”这一帽状结构而不能被DNA损伤反应和修复酶所识别。

而由于成纤维细胞缺乏端粒酶活性，导致了其每经过一个分裂周期，其端粒就缩短50～200bp[17]，一旦端粒缩短到一定临界值[18]，端粒的保护结构就会瓦解，从而染色体就不能维持稳定的结构，细胞因此失去了分裂增殖的能力而进入衰老的过程。

端粒严重缩短属于DNA损伤，损伤的DNA激活ATM／ATR介导的DNA损伤反应（DDR，DNA damage response）。

2007年Meier[19]等进一步研究表明。

短的端粒亚基缺少大部分端粒重复序列，它导致了DNA损伤聚积的形成和终末细胞周期停止从而引起复制性细胞衰老（senescence）[20]。

线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）损伤
mtDNA 是细胞核外遗传物质，为双链闭合环状结构，由16 569 bp 组成线粒体 DNA 是裸露的，缺乏组蛋白和DNA 结合蛋白的保护，易受氧自由基损伤，且损伤后因缺乏修复系统而不易被修复[21]。

因此，mtDNA突变率高，是核内 DNA的10～100倍[22]。

由于mtDNA 受到损伤，导致了呼吸链相关蛋白的合成遭受障碍，从而形成缺陷的呼吸链，使得机体细胞ATP合成水平降低，供给能量不足从而出现一系列衰老表现，尤其是心、脑等以ATP 为主要能源的代谢旺盛器官表现尤甚。

呼吸链功能下降，进一步引起自由基堆积，加重 mtDNA 损伤。

随增龄等因素，mtDNA 突变累积，形成恶性循环，从而加速细胞衰老[23]。

TNF-alpha炎症因子的诱导
肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor）是carswell[24] 1975年发现的。

他们发现这种物质对多种体外培养的肿瘤细胞有杀伤作用，然而对于正常细胞没有杀伤作用。

因此被称为肿瘤坏死因子。

TNF家族由 TNF-alpha和TNF-beta组成。

前者主要是由巨噬细胞产生，后者是由T细胞产生的淋巴毒素（LT）。

有研究显示炎症因子TNF-alpha在调解其他生理过程方面起着重要的作用，例如DNA损伤诱导、细胞增殖、凋亡和衰老。

许多临床病例表明，慢性炎症的发生与组织器官的衰老存在密切的联系，炎症因子在衰老过程中起着重要的作用。

许多慢性炎症病人体内的TNF-alpha高于正常人的
水平，而患有慢性炎症病人体内TNF-alpha等炎症因子长期维持在较高水平使得其组织器官更易发生衰老，例如慢性肝炎患者长期发展可以造成肝硬化，支气管炎患者容易发生肺纤维化等，而肝纤维化、肺纤维化都是组织器官衰老的表现。

2001年，周建军等人[25]研究发现，TNF-alpha不仅可以炎症刺激内皮细胞死亡还可以诱导内皮细胞发生衰老。

近几年随着研究的展开，motoko sasaki发现TNF-alpha 可以通过ros诱导DNA损伤从而激活ATM通路来引发上皮细胞的衰老。

在孙兆亮[26]的研究中发现，TNF-alpha可以诱导人成纤维细胞衰老，但是需要一定的时间依赖性。

活性氧簇（ROS,Reactive Oxygen Species）
活性氧簇（ROS）是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括超氧阴离子自由基、过氧化
氢、单线态氧、羟自由基、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等[27]。

ROS在细胞内可通过酶反应和非酶反应产生。

其中线粒体是细胞内ROS产生的主要来源。

由于线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)浓度较高, 大部分O2-歧化为H2O2 , 后者可穿过线粒体膜进人胞浆[28]。

细胞内膜系统如滑面内质网及过氧化物酶体里含有一些酶, 如细胞色素 p450 和 b3 家族、乙醇酸氧化酶、D -氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶等, 这些酶对脂溶性药物、不饱和脂肪酸、抗生素及其它代谢产物的氧化,也可产生H2O2 和O2 -等。

在调控细胞凋亡增殖的信号通路中，P13K/Akt信号通路发挥重要作用。

P13K/Akt信号通过激活卡通及其下游靶标FOXO-1,GSK-3等对促进细胞周期进展、增殖、生存和抗凋亡有重要作用。

有研究表明ROS的释放，可以激活络氨酸磷酸酶SHP-TP1导致Akt的去磷酸化，从而使Akt及其下游靶标失活，通过内源性途径引起细胞凋亡。

ROS可通过影响Akt－Hsp90的结合活性，增加Akt-PP2A之间的相互作用，引起Akt构象改变，通过阻断Akt活化诱导细胞凋亡。

并且ROS可氧化DNA 使其断裂或突变 DNA 复制和转录受阻。

如果ROS导致的DNA单链断裂发生于染色体端区末端 , 可能引发了衰老相关基因如p16和p21的过表达, 则端区缩短加快。

miRNAs
miRNAs是一组长度约为18～24nt、且不编码蛋白质的短序列RNA，广泛存在于真核生物中。

目前已发现的miRNAs可参与许多主要的细胞生物学过程，如机体生长、发育、增殖与分化、能量代谢、衰老、炎症等。

已有研究发现，敲除产生miRNAs的关键酶Dicer后，小鼠出现皮肤粗糙、毛发脱落等早衰的现象[29]。

一部分原因是因为底册人的下降升高了Arf水平，抑制了泛素化所导致的p53的降解，从而使p53和p21升高，促进了衰老的发生。

由此可见，miRNAs在皮肤衰老中起重要作用。

就之前研究而言，miR-17、miR-
19b、miR-20a在人皮肤成纤维细胞复制型衰老中表达下降[30]，且与p21等成负相关；在心肌细胞中，miR-100能调控mTOR通路[31]，从而调控衰老，其表达与衰老呈负相关，miR-217，miR-34a,miR-199a,miR-132能够负调控SIRT1[32]，促进细胞衰老；miR-24能与p16相结合[33]，一直起表达，miR-24的表达与衰老呈负相关[34]；miR-449a/b 能负性调控CDK6、cdc25A，促进细胞衰老[35]。

表观遗传学调控
与增殖、分化、凋亡等相似，细胞衰老不仅受到遗传学的调节，也受到表观遗传学的调控。

表观遗传学是衰老发生的重要调控机制，是在不改变DNA序列的情况下影响衰老基因的表达：主要包括DNA甲基化、基因沉默、基因组印记、RNA剪接、RNA编辑、RNA干扰、X染色体失活、染色质重塑、组蛋白修饰，即组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化和ATP 依赖性的染色质结构修饰、非编码RNA调控等。

已有研究报道p53、p21、p16，Rb、MAPK、PTEN等细胞周期调控因子均在细胞衰老起着重要作用，诱导细胞衰老的途径主要包括p53和p16-Rb两种途径。

DDR（DNA damage response）是细胞应对DNA损伤时感应损伤，从而延迟或阻滞细胞周期进程的一种分子信号通路。

DDR主要是通过p53途径诱导细胞衰老的，DDR分子信号传递通路中包含许多重要的蛋白质因子，比如ATM，ATR，Chk1，Chk2，MDM2[36]等。

由于衰老细胞的细胞周期常阻滞于G1/S和S期，所以G1/S期调控包括两条途径。

双链DNA的损伤由ATM感应，紫外线造成的损伤由ATR、Rad 17-RFC和9-1-1复合物感应[37]。

感应的ATM／ATR磷酸化Rad17、Rad9，p53和Chk1/Chk2等蛋白质，并使其激活。

激活的这些蛋白质进一步磷酸化Cdc25a。

磷酸化的Cdc25a蛋白通过核算外切或凡俗街道的途径而降解。

这一过程促进了Cdk2的磷酸化失活。

失活的Cdk2无法磷酸化Cdc45.由于Cdc45是复制起始重要的蛋白质因子，所以这一过程最终导致g1期向s期过渡的阻断。

另外一条途径是依赖于p53的作用[38]。

p53被ATM／ATR和Chk1/Chk2磷酸化以后，诱导p21WIF／Cip1转录。

p21WIF／Cip1与
Cdk4/CycD复合物结合，阻止起磷酸化Rb蛋白。

从而导致Rb蛋白无法释放E2F这一S期重要的转录因子，起了稳定的阻断作用。

紫外线（UV）
皮肤作为人体最大的器官，在日常生活中不可避免的会受到日光照射，而光老化是人体暴露部位皮肤衰老的主要原因。

日光中的 UV 分为短波紫外线（UVC，100～290nm）、中波紫外线（UVB，290～320nm）和长波紫外线（UVA，320～400nm）。

由于大气层中存在臭氧层，UVC 几乎被全部吸收，到达地面的
UV 主要为 UVA 和UVB。

日光中的 UV 主要通过下列机制使皮肤损伤[39]：①损伤 DNA；
②进行性蛋白质（如胶原）的交联；③通过诱导抗原刺激反应的抑制途径而降低免疫应答；
④产生高度反应的自由基与各种细胞内结构相互作用而造成细胞和组织的损伤。

UV 还可直接抑制表皮朗格罕斯细胞的功能，引起光免疫抑制，使皮肤的免疫监督功能减弱而引起皮肤的光老化。

UVB诱导衰老的机制
研究证明[40]UVB辐射后诱导成纤维细胞产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），MMP 属于锌依赖性的酶家族。

研究发现[41]，低剂量 UVB（30mJ/cm2）辐射人体皮肤，可导致 MMP-1 等基质金属蛋白的mRNA 以及蛋白水平的高表达，从而降解皮肤胶原，导致皮肤光老化。

一方面，UVB 辐射导致成纤维细胞直接产生的 MMP-1 和 MMP-3 含量增加；另一方面，表皮角质形成细胞在接受 UV 辐射后，会导致 IL-6 等细胞因子的分泌明显增加，IL-6 能显著增加成纤维细胞产生MMP-1 和 MMP-3，间接导致皮肤内 MMP 含量增加，从而导致光老化。

UVA诱导衰老的机制
UVA（340～400nm）在皮肤中诱导 ROS 的产生（主要是O2和H2O2）是主要的致病机理之一[42]。

UVA诱导皮肤产生的 ROS[43]，可进一步激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导通路，促进 MMP 的表达，同时抑制胶原的合成，从而造成光老化皮肤特征性的改变。

此外，UVA 可直接损伤体外培养的皮肤成纤维细胞，引起原代培养的真皮成纤维细胞形态发生皱缩、细胞贴附功能下降、致使悬浮细胞逐渐增加；MTT试验显示，随着 UVA 剂量的增加，细胞存活数显著下降。

总结与期望
衰老有称老化，一般是指生物体在正常生理状况下，其生长发育成熟后随着起年龄的增长额自身的生理功能出现退行性变化的不可逆转的现象。

机体的衰老其本质上也是细胞的衰老。

皮肤作为人体的最大的器官，皮肤的衰老可以反应出机体的衰老。

随着人们生活水平的提高，对于皮肤抗衰老的意识也有了进一步的提高。

成纤维细胞作为主要构成皮肤的结缔组织细胞，其衰老也能显示出皮肤的衰老。

有许多的因素可以导致成纤维细胞的衰老，例如基因组不稳定性、活性氧簇（ROS）、表观遗传调控、炎症因子诱导、微小RNA(miRNA)诱导以及紫外照射导致的光老化等。

随着研究的不断深入，成纤维细胞衰老的机制也愈发的清晰起来，无论是从整体水平,还是细胞与分子水平,各种学说相互之间并非对立,它们互为因果、
相互补充或同时作用,但都有其局限性。

可以
预料,探讨成纤维细胞衰老的新途径对于皮肤
抗衰老研究有重要的作用。

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