微生物脂肪酶的应用

微生物脂肪酶及其相关研究进展

摘要：微生物脂肪酶是一种重要的工业酶类，也是当前国内外研究的热点。就微生物脂肪酶在食品加工、手性化合物合成、脂肪水解、脂肪酸提纯、三甘酯结构测定和环境治理等方面的应用及研究近况进行综述。

关键词：微生物脂肪酶；催化；手性；应用

微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH 和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。尤其是1,3 专一脂肪酶，可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分，具有巨大应用潜力。经近20 年来的深入研究，能应用于工业生产的微生物脂肪酶种类不断增加，目前已遍及细菌、酵母及霉菌各大类中，最近公布的36 种不同来源的商业化脂肪酶中有19 种来源于真菌，8 种来源于细菌。同时，随着生物技术的日新月异，酶固定化技术、界面酶学和非水解酶学研究的突破性进展，使得人们对微生物脂肪酶产生了极大的兴趣。当前脂肪酶在国内外均有生产，微生物脂肪酶的多功能性不仅对传统的工业领域具有重要的影响，而且在许多新的工业领域也得到了广泛的应用[1-4]。

1 脂肪酶的来源及结构

1. 1 脂肪酶的来源

脂肪酶的来源非常广泛,在许多动植物及微生物中存在[5 ] 。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子,动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等,微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源,它包括细菌、酵母和霉菌产生的脂肪酶。

1. 2 脂肪酶的分子结构

脂肪酶是一种糖蛋白。其糖基部分约占分子量的2 %～15 % ,以甘露糖为主,整个分子由亲水部分和疏水部分组成, 活性中心靠近分子的疏水端。Brockerhoff 提出了脂肪酶在油—水界面定向的假设在研究了10 种脂肪酶的三维结构并比较了21种脂肪酶的区域选择性后如下结论。

1) 脂肪酶都包括同源区段:His —X—Y—G1y -Z —Ser —W—G1y —或Y—G1y —His —Ser —W—G1y(X,Y,W,Z 是可变的氨基酸残基) 。

2) 活性中心是丝氨酸残基,在正常情况下该残基受一个α—螺旋盖的保护,当脂肪酶与界面相接触时,此盖打开,通过亲电子域的创造导致脂肪酶的构象改变,此亲电子域在丝氨酸残基周围,由疏水残的暴露和亲水残基的包埋来完成。从而增加了脂类底物复合物的亲和性,并稳定了催化过程中的过渡态中间产物[6～8 ] ,而酶分子的周围通常存留一定量的水分,从而保证在油—水界面和有机相中的自体激活[10] 。脂肪酶在油—水界面上被激活的比率很高,可达10 倍以上(水解活力) 。Winkler 研究了猪胰脂肪酶和人胰脂肪酶的一级结构[11 ] ,发现其一级结构极其相似,从而显示了它们催化特性上的一致

性和相似性。

有些脂肪酶的界面吸附作用主要取决于界面的理化特性。而这些理化特性受磷脂或胆酸盐等的极大影响。当这类两亲物质存在时,甘油三酯一水界面的疏水/ 亲水平衡被打破,辅因子结合于脂肪酶特定位点并通过其疏水端吸附于界面,使活性中心周围的“flap lid”打开,显示出界面激活作用。

1. 3 微生物脂肪酶的产生菌及筛选方法

Fagery 规定优良产酶菌株的标准应是短时、营养基质低廉、菌株易分离、胞外酶、非致病菌、不产生毒素、遗传性状稳定及对噬菌体不敏感等。目前,产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉及假单胞菌等。脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选择性强及易于自动化上。谢舜珍采用油脂同化平板,以油为唯一碳源进行同化试验并测定摇瓶发酵培养后的发酵液酶活力。沈永祥等[12 ]筛选到一株脂肪酶菌—阿氏假囊酵母。施巧琴[13 ]

利用脂肪酶作用脂肪后产生脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝绿色的透

明圈平板法经摇瓶发酵复筛得到产碱性脂肪酶的扩展青霉。

Rollof ,J 等[14]从患频发性疖病人身上分离到产脂肪酶的金黄色

葡萄球菌。近年来随着细胞工程、基因工程、固定化技术的兴起,脂肪酶的研究特别是对产脂肪酶的菌株诱变育种及基因克隆等方面取

得长足进展。1979 年, 我国研究开发了解脂假丝酵母AS211405。它是紫外线及亚硝基胍处理选育出的脂肪酶高产变株,施巧琴[15 ]对

产碱脂肪酶596 用亚硝基胍,紫外线,盐酸羟胺,秋水仙碱等诱变因子进行作用得酶活力为原始菌16. 6 倍的突变株Un —503 ,每毫升发酵

液活力达

400 U 以上。Ibrahim ,C. 0 对由绵毛状腐质霉产生的脂肪酶用Amberlile xAD —7 和戊二醛交联法制得一种固定化酶。Motoyasu ,O 等报道了脱氮产碱杆菌TK7 和绿脓假单胞菌OLI 脂肪酶生产基因用RP4 :Mu 质粒转移到大肠杆菌JA2211上,重组克隆分子拥有原菌体的80 %～115 %的脂肪酶活力。

2 脂肪酶的应用

2.1 食品加工方面的应用

脂肪酶现已用于奶制品，如奶酪、奶油和人造黄油的增香。因为奶制品中的香味是牛奶中的脂肪、蛋白质和乳糖代谢的产物，因此，脂肪酶和蛋白酶被广泛地用于加快奶酪的熟化和香味的产生。用脂肪酶处理过的奶制品比未处理的具有更好的香味和可接受性。除奶制品外，脂肪酶也用于改善稻米和酒精饮料的香味，如在酒精饮料的发酵过程中加入一定量的脂肪酶，产品具有类似奶酪的香味。脂肪酶还用于无脂肪肉的生产，如在鱼加工过程中脂肪的去除是用脂肪酶来完成的。另外，在生面团中加入脂肪酶使三甘酯部分水解而增加单甘酯的含量可延缓腐败，单甘酯和双甘酯的形成也使蛋白的起泡性质得到改善。

2．2 手性化合物合成中的应用

脂肪酶催化具有高底物专一性、区域选择性或对映选择性等优点，使其成为有机合成中重要的生物催化剂。脂肪酶催化合成手性化合物的基本类型有两个：(1)前手性底物的反应；(2)外消旋化合物的拆分。催化的底物已由传统的前手性或手性醇和羧酸酯扩展到二醇