实验三 人类染色质体的检测

实验三人类染色质体的检测

一、实验目的

1．通过人口腔粘膜细胞性染色质的观察学习有关异染色质、功能性异染色质、x 染色体失活等有关知识，

2.学习性染色质制备、观察与分析的方法。

二、实验原理

早在六十年代，Barr和Bertram在雌性猫的神经细胞核中发现，在多数核中部有一个小的深染的小体，而在雄性猫的同样细胞中只能偶而观察到这种小体，此后许多人的研究指出这种与性别有关的两型现象在有袋类、偶蹄类、食肉类和灵长类等动物的多数组织细胞中存在，而在噬齿类中只在少数组织中可以观察到。

这种染色质小体现在称为“性染色质”(sex chromatin)，或称为“巴氏小体”(Barr body)。这种小体常位于核膜的内表面，呈Feulgen阳性反应，表明是DNA的成分(图1)，

有证据表明，性染色质的存在是由于在雌性哺乳动物核中存在两个X染色体，其中一个X染色体处于失活状态。雄性个体只有一个X染色体。因此原则上男性不应有性染色质．但如果一个男人有XXY染色体，那就会有一个性染色质，虽然表现为男性。同样，XXX的三体应当有两个巴氏小体。因此，性染色质实质上是一个失活的X染色体。

为什么失活的X染色体会以巴氏小体的形式显示出来?目前，已有许多证据证明，在雌性个体中那根失活的X染色体已经异染质化，成为功能性异染质。使用放射自显影的方法已经证明，失活的X染色体的固缩周期与其它染色体是不同步的，它在S期是晚复制的。此外，人们也已发现，晚复制的这根X染色体常位于核的边缘，这个位置也正好是巴氏小体出现的位置。

三、实验准备

1.器材：显微镜，镜油瓶，镊子，擦镜纸，漱口杯(灭菌)，压舌板(灭菌)，清洁玻片、盖玻片。

2.试剂：二甲苯，5N HCl，1％硫堇水溶液，蒸馏水、封固剂；酒精：50％，70％，95％，纯酒精。

四、实验步骤

（一）材料的获得

从自己的口腔粘膜取材，有两点需要特别注意的事项。首先载片要绝对清洁，否则在操作过程中上皮细胞会脱落，导致实验失败。玻片需经过预先处理、可用去污剂彻底清洗，蒸馏水彻底冲洗后再经70%酒精的冲洗，在火焰上烘干备用。

另外一个比较难以克服的问题是如何避免口腔的上皮细胞被口腔中的细菌污染。这将造成特殊的麻烦，因为细菌也很容易被染色，如果碰巧也处于核膜附近就很容易和性染色质混淆。可以部分克服的办法是事先用自来水漱口三次。这将可以部分除去细菌和—些即将脱落的已退化的粘膜上皮细跑。

用牙签刮面颊内壁，将刮下来的细胞涂在载片上，应涂成一个占较大面积的

薄层，在空气中干燥30分钟后进行染色程度的处理。请至少制备两张涂片。（二）染色

1、口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察

刮取颊部粘膜上皮细胞（用灭菌玻璃片）→涂片→60%冰醋酸固定5分钟→吸去冰醋酸，用醋酸洋红染色20～30min→压片→镜检

2、发根细胞巴氏小体观察

1）拔取带毛囊头发一段→45%冰醋酸解离5分钟→剥取毛囊→醋酸洋红染色20～30min→压片观察

（三）观察与报告

1．镜检制片，

先用低倍镜找到细胞，低倍镜下检出典型的可数细胞的标准：

①核质是网状或细颗粒状分布

②核膜清晰、核无缺损

③染色适度

④周围无杂菌

应避开细菌污染较多的区域。重叠的细跑、折叠的细胞、染色过深或过浅的细胞以及核质已颗粒化显示退化的细胞等都不应在统汁数字之内。性染色质的观察应在油镜下进行，要注意小心操作。

2．性染色质位于核膜的内面，直径大约1um。在口腔粘膜上皮细胞中很难辨认非边缘的X染色质。形状有凸形、三角形、卵形、短棒及双球形等。

3．性染色质偶尔也可在雄性细胞中观察到，在口腔粘膜中正常的阳性范围是2％。在女性口腔粘膜上皮细胞中，阳性率在15％以上。许多研究人员认为在健康的上皮细胞中可观察到性染色质的可占50%-65%。

五、作业

在报告纸上报告制片结果并回答下述问题。

1.检查制片的质量，存在什么问题?

2.镜检自己的制片，观察50个以上细胞，计算具有性染色质的细胞的百分数，性染色质的数量和性染色质的大小。

3.观察中选绘4～5个典型细胞(女性)，绘图示明X染色质体的形成和部位。

4. 为什么某一X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？

5.正常男人的染色体组成是44+XY，而正常女人的染色体组成是44+XX，请按要

实验四ABO血型鉴定

【实验目的】

熟悉ABO血型鉴定的方法，充分认识输血时血型不合所造成的严重后果。【实验原理】

血型就是红细胞膜上特异抗原的类型。在ABO血型系统中，红细胞膜上抗原分A和B两种抗原，而血清抗体分抗A和抗B两种抗体。A抗原加抗A抗体或B抗原加抗B抗体，则产生凝集现象。血型鉴定是将受试者的红细胞加入标准A型血清（含有抗B抗体）与标准B型血清（含有抗A抗体）中，观察有无凝集现象，从而测知受试者红细胞膜上有无A或/和B抗原。在ABO血型系统，根据红细胞膜上是否含A、B抗原而分为A、B、AB、O四型。

【实验对象】

人体

【实验器材和药品】

1．器械采血针，消毒注射器，双凹玻片，小试管，竹签，棉球，。

2．药品标准A血清，标准B血清，生理盐水，75％酒精，碘酒。

【实验步骤】

ABO血型鉴定

玻片法

（1）取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用腊笔标明A 及B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。

（2）细胞悬液制备从指尖或耳垂取血一滴，采血时应注意先用75％酒精消毒指尖或耳垂。

（3）分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。

（4）竹签两头分别混合，搅匀。

（5）如有凝集反应可见到呈红色点状或小片状凝集块浮起。先用肉眼看有无凝集现象，肉眼不易分辨时，则在低倍显微镜下观察，如有凝集反应，可见红细胞聚集成团。

（6）判断血型根据被试者红细胞是否被A，B型标准血清所凝集，判断其血型。（见下图）

【注意事项】