流式淋巴细胞亚群检测技术原理(培训调研)
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淋巴细胞亚群检测
精编课件
1
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
精编课件
2
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
精编课件
固有免疫 NK细胞
3
检测方法
精编课件
22
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
精编课件
23
精编课件
24
杀伤特点： 连续性杀伤 特异性杀伤 MHC限制性
精编课件
25
T8细胞增高
提示体内存在病毒或胞内寄生菌等病原微生物感染 主要见于HIV、HBV、CMV、EB等病毒感染 也可见于结核杆菌感染等
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
精编课件
4
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
精编课件
28
T4/T8细胞比值降低
是T4细胞减少或T8细胞增高所致 见于艾滋病、再生障碍性贫血、某些白血病、传染性单核
细胞增多症、免疫缺陷综合征、某些病毒感染、恶性肿瘤、 结核病等 一般来说，导致T4/T8比值倒置，以全身性、侵袭和破坏 机体免疫系统的感染引起的倒置变化幅度最大 临床抗感染治疗有效时，可以观察T4/T8细胞比值的逐步 恢复
精编课件
26
T8细胞降低
移植排斥反应 可见于γ免疫球蛋白缺乏症 胸腺发育不良 严重联合免疫缺陷病 糖尿病等
精编课件
27
T4/T8细胞比值增高
是T4淋巴细胞增高或T8淋巴细胞减少所致 见于某些自身免疫性疾病，如SLE、多发性硬化、器官移
植排斥反应、自身免疫性溶血性贫血等
抗原特异性 CD40L IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, 体液免疫
B 细胞
GM-CSF, TGF-
CD8+ 抗原肽+ 感染病毒的 FasL 穿孔素, 粒酶，IFN-, -细胞免疫
CTL I 类分子 靶细胞
TNF-, TNF-
精编课件
19
精编课件
20
T4细胞增高
提示体内存在细菌等病原微生物感染，主要见于临床各种 细菌性感染性疾病。
精编课件
11
检测目的
功能
数量
1
相互协作 共同参与
比例
精编课件
12
T、B细胞相互作用
精编课件
13
精编课件
14
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
精编课件
15
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
B细胞 CD3-CD19+
器官移植发生排斥反应 支气管哮喘 SLE活动期 某些免疫增强药物的有效结果 注意:昼夜变化（傍晚的峰值可为上午的两倍）
精编课件
21
Biblioteka Baidu
T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、 严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
精编课件
29
T4/T8细胞比值临床意义
NK细胞 CD3-CD（16+56）+
精编课件
16
总T细胞增高
提示体内的T细胞免疫功能增强 见于临床某些自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、
慢性活动性肝炎、甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、 器官移植排斥反应、T细胞性白血病等
精编课件
17
总T细胞降低
提示体内的T细胞免疫功能减弱 见于某些白血病、应用免疫抑制剂药、放疗过程中、先天
精编课件
8
免疫荧光染色
FCM可检测下列细胞成分：
表面标记物
胞浆标记物 核内标记物
核内抗原
可溶性成分
黏附因子
表面受体
精编课件
分泌到胞外的 细胞因子
细胞因子 核酸含量
胞内抗原
9
联合CD45的四色方案
第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色标记，主要可以检测 T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同的亚群
精编课件
7
常用荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7
激发光波长 （nm）
488 488 490 633 488 488
发射光波长 （nm）
525 575 675 660 670 755
中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5
精编课件
10
联合CD45的四色方案
第二种是用CD45/CD3/CD19/CD16和（或）CD56做第二管的 标记，用于检测T3细胞、B细胞和NK细胞
CD45-FITC CD56-RD1 CD19-ECD CD3-PC5
性细胞免疫缺陷、艾滋病、多发性骨髓瘤、传染性单核细 胞增多症，以及过劳等造成机体免疫功能处于相对较低的 其他一些情况
精编课件
18
T 细胞的三个功能性亚群
效应分子
亚群 TCR 配体 作用靶目标
表面表达
分泌性
应答类型
CD4+ 抗原肽+ Th1 II 类分子
CD4+ 抗原肽+ Th2 II 类分子
胞内感染的 CD40L IFN-, GM-CSF, TNF- 细胞免疫 巨噬细胞 FasL IL-3, TNF-, IL-2
精编课件
5
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
荧光抗体
第一抗体
荧光二抗
直接标记
间接标记
精编课件
6
常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue） 500-549nm，绿色荧光（Green） 550-584nm，黄色荧光（Yellow） 585-615nm，橙色荧光（Orange） 616-700nm，红色荧光（Red） ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）
精编课件
1
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
精编课件
2
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
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固有免疫 NK细胞
3
检测方法
精编课件
22
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
精编课件
23
精编课件
24
杀伤特点： 连续性杀伤 特异性杀伤 MHC限制性
精编课件
25
T8细胞增高
提示体内存在病毒或胞内寄生菌等病原微生物感染 主要见于HIV、HBV、CMV、EB等病毒感染 也可见于结核杆菌感染等
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
精编课件
4
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
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28
T4/T8细胞比值降低
是T4细胞减少或T8细胞增高所致 见于艾滋病、再生障碍性贫血、某些白血病、传染性单核
细胞增多症、免疫缺陷综合征、某些病毒感染、恶性肿瘤、 结核病等 一般来说，导致T4/T8比值倒置，以全身性、侵袭和破坏 机体免疫系统的感染引起的倒置变化幅度最大 临床抗感染治疗有效时，可以观察T4/T8细胞比值的逐步 恢复
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26
T8细胞降低
移植排斥反应 可见于γ免疫球蛋白缺乏症 胸腺发育不良 严重联合免疫缺陷病 糖尿病等
精编课件
27
T4/T8细胞比值增高
是T4淋巴细胞增高或T8淋巴细胞减少所致 见于某些自身免疫性疾病，如SLE、多发性硬化、器官移
植排斥反应、自身免疫性溶血性贫血等
抗原特异性 CD40L IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, 体液免疫
B 细胞
GM-CSF, TGF-
CD8+ 抗原肽+ 感染病毒的 FasL 穿孔素, 粒酶，IFN-, -细胞免疫
CTL I 类分子 靶细胞
TNF-, TNF-
精编课件
19
精编课件
20
T4细胞增高
提示体内存在细菌等病原微生物感染，主要见于临床各种 细菌性感染性疾病。
精编课件
11
检测目的
功能
数量
1
相互协作 共同参与
比例
精编课件
12
T、B细胞相互作用
精编课件
13
精编课件
14
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
精编课件
15
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
B细胞 CD3-CD19+
器官移植发生排斥反应 支气管哮喘 SLE活动期 某些免疫增强药物的有效结果 注意:昼夜变化（傍晚的峰值可为上午的两倍）
精编课件
21
Biblioteka Baidu
T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、 严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
精编课件
29
T4/T8细胞比值临床意义
NK细胞 CD3-CD（16+56）+
精编课件
16
总T细胞增高
提示体内的T细胞免疫功能增强 见于临床某些自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、
慢性活动性肝炎、甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、 器官移植排斥反应、T细胞性白血病等
精编课件
17
总T细胞降低
提示体内的T细胞免疫功能减弱 见于某些白血病、应用免疫抑制剂药、放疗过程中、先天
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8
免疫荧光染色
FCM可检测下列细胞成分：
表面标记物
胞浆标记物 核内标记物
核内抗原
可溶性成分
黏附因子
表面受体
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分泌到胞外的 细胞因子
细胞因子 核酸含量
胞内抗原
9
联合CD45的四色方案
第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色标记，主要可以检测 T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同的亚群
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7
常用荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7
激发光波长 （nm）
488 488 490 633 488 488
发射光波长 （nm）
525 575 675 660 670 755
中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5
精编课件
10
联合CD45的四色方案
第二种是用CD45/CD3/CD19/CD16和（或）CD56做第二管的 标记，用于检测T3细胞、B细胞和NK细胞
CD45-FITC CD56-RD1 CD19-ECD CD3-PC5
性细胞免疫缺陷、艾滋病、多发性骨髓瘤、传染性单核细 胞增多症，以及过劳等造成机体免疫功能处于相对较低的 其他一些情况
精编课件
18
T 细胞的三个功能性亚群
效应分子
亚群 TCR 配体 作用靶目标
表面表达
分泌性
应答类型
CD4+ 抗原肽+ Th1 II 类分子
CD4+ 抗原肽+ Th2 II 类分子
胞内感染的 CD40L IFN-, GM-CSF, TNF- 细胞免疫 巨噬细胞 FasL IL-3, TNF-, IL-2
精编课件
5
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
荧光抗体
第一抗体
荧光二抗
直接标记
间接标记
精编课件
6
常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue） 500-549nm，绿色荧光（Green） 550-584nm，黄色荧光（Yellow） 585-615nm，橙色荧光（Orange） 616-700nm，红色荧光（Red） ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）