亲和层析纯化重组蛋白

亲和层析纯化重组蛋白

【实验目的】

学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白。

【实验原理】

利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性，(Q往圣科技3452125268提供Science 的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag，则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化，经过低浓度咪唑溶液洗涤后，可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来，纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE

法进行检测。

【器材与试剂】

1．实验仪器摇床，高速冷冻离心机，超声波细胞破碎仪，微量移液器，电泳仪，蛋白电泳槽

2．实验试剂蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2，镍离子螯合树脂（His.Bind Resin，美国Novagen公司），结合缓冲溶液：0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；洗涤缓冲液：0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑，20 m mol/L Tris-Cl，pH8.0；洗脱缓冲液：0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；30%凝胶贮液：29% 丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10% 十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费)蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8)，蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸

3．实验材料转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)（工程菌）

【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)

1．取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内，待凝胶沉淀且保护剂流净后，用10 mL蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液，待其流干净后，用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。

2．接种工程菌于20 mL含100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡培养（250 r/min）过夜。

3．将过夜培养物转接到500 mL含100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡培养（250 r/min）3 h，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4h。

4. 培养物在4℃，5 000×g离心10 min，收集菌体。

5．菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中，冰浴条件下用超声波破碎细胞15次（800W,工作时间10 s，间隔时间60 s）。

6．细胞裂解液于4℃，12 000×g离心30 min，取上清液，保留50 µL以备电泳分析。7．将其余上清液加到层析柱内，让其自然流过层析介质。

8．先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱，再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。

9．用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。

10．分别取10 µL细胞裂解液、洗脱液与10 µL蛋白载样缓冲液（2×）混合，煮沸5 min，SDS-PAGE分析，观察纯化效果。

【注意事项】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装。)层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂，以免将树脂上的Ni2+洗掉，导致无法纯化出蛋白