黄连内生真菌分离培养条件筛选
黄连内生真菌分离培养条件筛选
摘要：本试验采用压贴法通过对黄连根、茎、叶在不同次氯酸钠浓度及不同表面消毒时间的PDA培养基上的培养，选出黄连内生真菌的适宜培养条件；在获得适宜培养条件后重新培养所有部位，待其长菌后挑选菌落边缘菌丝再培养，如此反复，直到获得纯培养物为止。通过培养筛选在主根、须根、叶柄、叶片四个部位共获得了60多种菌株，并对分离出的菌株进行保种，为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。
关键词：黄连，内生真菌，分离条件，培养条件
Endophytic fungi of Coptis separation and culture conditions
screening
Abstract: The test select the suitable cultivation condition of endophytic fungi ,using pressure stick method cultivate roots, stems and leaves on PDA medium at different concentrations of sodium hypochlorite and different surface sterilization time.Recultivate all parts after acquising suitable cultivation,then select ege colonies and recultivate when they grow fungi,then circulate the procedure,until get pure culture.By cultivating and selecting the roots,fibrous roots,petiole and leaves, more than 60 kinds of fungi are found ,and isolated strains are breed,which is preparation for subsequent strains of identification, the determination of strains antimicrobial activity.
Keywords: Coptis, Endophytic fungi, Separation conditions, Culture conditions 黄连（Coptis chinensis Franch）是我国名贵中药材之一，含有大量的异喹啉类生物碱[1]（小蘖碱、黄连碱、甲基黄连碱、小蘖红碱、药根碱、阿魏酸等）。尤其是小蘖碱对人体病原细菌和皮肤真菌[2]具有广谱的抗菌活性，在医药中被广泛应用；同样，小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌也有显著的抑制作用。Hirano, H.等用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病（BBMV）的发生[3]。
黄连的药理研究主要以小蘖碱和黄连解毒汤为重点，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）[4]、镇静作用、止泻作用、健胃作用[5]、对心脏心率[6]和心律作用等[7]。黄连及复方临床应用常用于治疗痢疾、急性肠胃炎、慢性腹泻、呼吸道感染、白喉、百日咳、结核性胞膜炎、萎缩性鼻炎、流行性结膜炎、化脓性中耳炎、口疮、牙周炎、萎缩性胃炎、胃
炎、胃及十二指肠溃疡、慢性胆囊炎等，近年来还研究发现黄莲具有较强的抗癌和降血糖功效。
黄连药效作用广泛，历来为医家常用药材，而无节制的开放，野生资源已经枯竭，黄连栽培条件苛刻，生长周期长，难以满足医药生产的需要[8]。因此迫切需要寻找开发新的资源。大量的研究发现[9, 10]，内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物，是新化合物、新药物的潜在资源。开发和利用植物内生真菌在保护植物物种资源、探索新的产物和新的活性以及提高活性成分的生产效率等方面都具有重要的价值。从目前已经研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推断出内生真菌在植物内是普遍存在的。
内生真菌-植物共生体[11]能产生多种次生代谢产物，用来抵御自然界的虫害，吸引有益微生物和传粉者，竞争阳光和营养等。内生真菌在植物体与外界环境的交流中发挥着重要的作用，为了增加对病原微生物的抵抗，他们产生新的抗菌素[12]，这些抗菌素具有环保，高效的特征，是新抗菌素的主要来源，也是生物控制的一个重要手段。将有益的内生真菌接种于药用植物无菌苗的体内，能够缩短组织培养周期，对植株的生长发育和生理代谢进行综合调节，促进宿主药用植物活性成分的合成和积累，提高有效成分的含量。此外，还可以将有益的内生真菌进行合理的优化组合，获得相应的“内生真菌集群”[13]。
目前，国内外未见对黄连内生真菌研究的报道，故笔者预研究我国黄连主产区——重庆石柱的黄连的内生真菌分离培养条件及菌株保存，为寻找含有与黄连相似或相同化合物的菌株打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
新鲜无可见病斑的石柱黄连（C. chinensis Franch）的主根、须根、叶柄、叶片。
1.2 试验试剂
青霉素；硫酸链霉素；75%乙醇；次氯酸钠溶液（9%、4.5%、2.25%）（浓度以有效氯含量计）；
1.3 培养基的配置
PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂；
不同浓度PDA双抗培养基：以马铃薯20%、葡萄糖2%为基础，分别稀释为12.5%、25%、50%、75%、100%后，再加入琼脂2%，灭菌后稍加冷却，然后加入120ug/mL青霉素和100ug/mL硫黄霉素。
1.4 仪器设备
托盘天平、烧杯、量筒、剪刀、培养皿、注射器、酒精灯、镊子
电热蒸馏水器：WS2-226-77 HS?Z11-5型，北京长安科学仪器厂
电子万用炉：220V?AC 1000W 天津泰斯特仪器有限公司
电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9108A型，上海精宏试验设备有限公司
立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40SAI型，上海申安医疗器械厂
超净工作台：SW-CJ-2F，苏净集团安泰公司制造
电热恒温培养箱：DNP-9082，上海三发科学仪器有限公司
光照培养箱：MGC-250，上海一恒公司
1.4 试验方法
1.4.1 表面灭菌方法筛选
自来水将整株黄连彻底冲洗干净晾干后，分别取下主根、须根、叶柄、叶片，切割成较大的块，再按下面的方法对试验组及对照组进行处理：
CK1：无菌操作的全过程中将5皿打开盖子的PDA的培养皿放于超净工作台。在试验组处理完后以相同方式培养。
CK2：取适量最后一次漂洗液涂布于PDA培养基中，涂布2皿
CK3：取材料压入PDA培养基中，待0.5h后取出材料，重复10次。
主根：在75%乙醇中处理40 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；
叶柄：在75%乙醇中处理30 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；
叶片：在75%乙醇中处理20 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理1 min、3 min、5 min；
须根：在75%乙醇中处理10 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理0.5 min、1 min、3 min；
将经过以上消毒处理的材料材料接种于PDA培养基中，重复10次。置于25℃中培养，未接种材料的皿培养7天后观察是否有菌长出。接种材料的皿观察菌长出的时间，生长速度、长出菌量。
1.4.2 分离培养条件筛选
将黄连的主根、须根、叶柄、叶片以前面筛选出的表面消毒时间处理后，接种于不同浓度PDA培养基中，分别于15℃、25℃的培养条件下倒置培养。各材料接种20皿，每变量放置2皿。观察生长出真菌的时间、生长出的数量、生长速度。
1.4.3 内生真菌的分离纯化
培养7天后取各个菌落边缘的菌块接种于PDA培养基上，培养4天后再次取菌落边缘菌丝接种，如此反复多次，直到获得纯培养物为止。
1.4.4 保种
用水浴保种的方法对纯化所得的菌株进行保种。用灭菌的大头针挑取纯化的菌落的一部分，放入1.5mL的无菌EP管中，加入无菌水至淹没菌种，密封保存。
2 结果与分析
2.1 表面消毒条件筛选
2.1.1 主根表面消毒的筛选
表1 主根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率
Table 1 The percentage of growing fungi on root at different times of the surface concentration in
sodium hypochlorite disinfecting
次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间
（min）
第4日长菌率
（%）
第7日长菌率
（%）
第10日长菌
率（%）
对照是
否长菌
9 6 17 50 83 - 8 0 0 0 -
10 0 0 0 -
4.5 2 0 100 100 - 4 0 20 90 - 6 0 33 83 - 8 40 80 80 - 10 0 17 17 -
2.25 2 20 100 100 + 4 0 60 100 + 6 17 33 67 + 8 33 67 83 + 10 33 100 100 +
注：“-”表示未长菌，“+”表示长菌，下同。
通过表1数据可以发现在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组有菌长出，说明浓度过低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组几乎无菌长出，表明浓度过高；在浓度为4.45时，比较发现4min、6min的消毒时间为最佳时间，故选择次氯酸钠浓度为4.5%和消毒时间4min作为最佳筛选条件，既达到消毒水平也最节约时间。
2.1.2 须根表面消毒的筛选
表2 须根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率
Table 2 The percentage of growing fungi on fibrous root at different times of the surface
concentration in sodium hypochlorite disinfecting
次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间
（min）
第4日长菌率
（%）
第7日长菌率
（%）
第10日长菌
率（%）
对照是
否长菌
9 0.5 13 25 50 -
1 13 25 50 - 3 13 25 25 -
4.5 0.5 50 75 100 -
1 38 75 88 - 3 0 0 13 -
2.25 0.5 38 75 88 +
1 38 75 63 - 3 38 88 63 +
对表2数据分析发现：在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组不仅有真菌长出还有细菌长出，说明浓度太低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组的长菌率只有50%，偏
小不适合；在浓度为4.5%时，0.5min、1min的消毒时间较好，考虑试验过程的方便性，选择消毒时间1min为最佳时间，故须根的表面消毒筛选条件为：在4.5%的次氯酸钠中1min。
2.1.3 叶柄表面消毒时间的筛选
表3 叶柄在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率
Table 3 The percentage of growing fungi on petiole at different times of the surface concentration
in sodium hypochlorite disinfecting
次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间
（min）
第4日长菌率
（%）
第7日长菌率
（%）
第10日长菌
率（%）
对照是
否长菌
9 6 30 30 60 - 8 10 20 0 - 10 40 30 10
4.5 6 50 40 100 - 8 70 70 100 - 10 10 10 50 -
2.25 6 60 90 100 - 8 100 100 100 - 10 100 100 100 -
从表3数据也可看出在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组已没有菌长出，比较分析选择消毒时间6min作为最佳条件，因此叶柄的表面消毒筛选条件为：在2.25%的次氯酸钠中6min。
2.1.4 叶片表面消毒的筛选
表4 叶柄在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率
Table 4 The percentage of growing fungi on leaves at different times of the surface concentration
in sodium hypochlorite disinfecting
次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间
（min）
第4日长菌率
（%）
第7日长菌率
（%）
第10日长菌率
（%）
对照是
否长菌
9 1 20 50 70 - 3 0 40 60 - 5 0 20 40 -
4.5 1 50 70 100 - 3 30 80 100 - 5 40 60 80 -
2.25 1 50 80 100 + 3 50 80 100 + 5 50 70 100 +
观察表4数据可发现，在次氯酸钠浓度2.25%时，对照组有菌长出，说明消毒浓度不够；在次氯酸钠浓度4.5%及9%时，对照组都无菌长出，对比发现次氯酸钠浓度4.5%且3min时最适宜叶柄的表面消毒。
2.2 培养条件的筛选
表5 对培养条件的筛选
Table 5 Screening of culture conditions
温度（℃）PDA浓度（%）4天后7天后10天后
15 12.5 无菌长出开始长菌长势缓慢25 无菌长出开始长菌长势缓慢50 无菌长出开始长菌长势缓慢75 无菌长出开始长菌长势缓慢100 开始长菌长势缓慢长势缓慢
25 12.5 无菌长出长势缓慢长势良好25 无菌长出长势缓慢长势良好50 开始长菌长势良好生长旺盛75 开始长菌长势良好生长旺盛100 开始长菌长势良好生长旺盛
注：从得到的试验结果发现4个部位的温度浓度培养结果基本一致，故在此只列出一个表格说明。
各部分材料在前面筛选出的表面消毒时间处理后，接种于PDA双抗培养基，试验中选择了15℃、25℃两个温度条件进行培养，观察发现它们都在25℃时长势较好，因此最后的培养条件选择25℃进行培养。在对不同浓度的PDA培养基选择时发现常规培养基能使黄连内生真菌很好生长，因此培养基还是按照100%配置。
2.3 菌株的分离及保种
按照上述试验结果获得的最佳表面灭菌、最佳培养条件重新接种一批材料。7天后，用接种环挑取各个菌落边缘的菌丝接种于双抗培养基上，培养4天后再次挑取边缘菌丝接种，经过多次反复的培养最后从主根分离出14种，须根7种，叶柄24种，叶片21种共60多种菌株。在最后一次的培养基上用灭菌的大头针挑取纯化的菌落的一部分，放入1.5mL
的EP管中，加入无菌水至淹没菌种，密封保存。
3 讨论
本试验是首次对黄连的内生真菌进行分离培养，但在禾本科植物中分离内生真菌的应用已经相当广泛[11, 14]，技术比较成熟，具有借鉴作用。通过试验获得了适宜黄连各部位表面消毒和培养的条件，为今后黄连药物的研究能够提供一些帮助。
从表1~4的结果分析可看出除叶柄外，其他部位消毒浓度都在4.5%达到最佳效果，原因可能是黄连叶柄表面十分光滑且有木质部的存在，使得表面附着的真菌、细菌难以生长，从而在2.25%时就能打到最佳效果。由于都是同一植株的内生真菌，他们对培养的条件要求几乎一致，在常规的PDA培养基和室温条件能很好的生长。植物体内不仅仅含有真菌，同时还含有细菌，因此在最后的分离时选择了加入青霉素和硫酸链霉素的双抗PDA培养基来抑制细菌的生长[15]，从而更好的分离真菌。分离后保种的菌株能够为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。
4 结论
主根的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤40 s，4.5%的次氯酸钠溶液4 min；叶柄的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤30 s，2.25%的次氯酸钠溶液6 min；叶片的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤20 s，4.5%的次氯酸钠溶液3 min；须根的最佳表面消毒时间为75%乙醇溶液洗涤10 s，2.25%的次氯酸钠溶液1 min。最佳分离培养条件为25℃，100%浓度的双抗PDA培养基。
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植物内生菌的分离
植物内生菌的分离 钱昆121140041 一、实验目的 1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。 2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。 3、了解微生物分子实验的基本操作流程。 二、实验原理 在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。 内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。 内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。 对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。但需要注意的是，同种细菌定殖于不同宿主植物可能对宿主植物产生不同的影响。 除根瘤菌外，还有放线菌侵入多种被子植物宿主，形成根瘤的共生固氮体系。早在十九世纪后期，人们就发现了这类非豆科的根瘤，并发现根瘤内有生微生物，1881年布隆科斯特将它称为Frankia，但当时并不知道它是什么微生物。确定内
几种真菌的分离与鉴定教学文案
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
真菌培养基
真菌培养基 一、沙保罗琼脂培养基 [用途] 供真菌及酵母样真菌的分离培养用。 [配法] 麦芽糖40g,蛋白胨10g,琼脂20g，蒸馏水1L。 将上述成分溶于水，加热溶解，调pH至6.0±0.2，分装三角瓶或试管中，118℃灭菌15mi n，倾注平板或置斜面，无菌试验后备用。 [用法] 将标本接种培养基，如系血液标本，则采取1～2ml，与冷却至45℃左右沙保琼脂混合，倾注接种平板。分别置35℃和25℃恒温箱内同时培养。35℃培养48h,25℃需连续培养5天,逐日观察结果。发现真菌及酵母样可疑菌落，转种沙保菌斜面，获得纯培养后进行鉴定。 [质量控制] 白色念珠菌和新型隐球菌生长良好。 注： ⑴本培养基如不加入琼脂，即为沙保罗液体培养基，供真菌及念珠菌的增菌培养用。 ⑵增加氯霉素0.05～0.125mg/ml或放线菌酮0.5mg/ml，可抑制细菌和污染的霉菌及隐球菌生长。此二种药均耐热，可直接加入培养基内高压灭菌。 ⑶添加酵母浸膏5mg/ml，可促进皮肤癣菌生长。增加维生素B 0.1mg/ml，可促进紫色癣菌和断发癣菌生长。 ⑷将麦芽糖减少到20g/L，为沙保罗20g/L麦芽糖琼脂培养基，可供诱导真菌产生孢子用。 ⑸该培养基呈酸性，应提高20%的琼脂用量。 二、玉米粉琼脂培养基 [用途]
鉴定酵母样真菌用。白色念珠菌在该培养基上25℃24h培养可长出假菌丝，顶端有典型的厚壁孢子，可与其它念珠菌鉴别。 [配法] 玉米粉4g，琼脂粉8g，蒸馏水1L （pH6.0±0.2）。 将细米粉加水浸泡数分钟，扎紧瓶口，浸入60℃水浴4h，取出后用沙布过滤，除去粗渣，补足水分。无须调整pH。加入琼脂，煮沸溶解，有沉淀物再过滤1次，分装试管，121℃灭菌15min备用。 用玻璃片法点种后，置平皿内，保持一定湿度，置23～26℃下培养24～48h。取出玻片培养物，用高倍镜观察真假菌丝和有无厚壁孢子。 [质量控制] 白色念珠菌（ATCC 26790）厚膜孢子阳性；新型隐球菌（ATCC 9763）厚膜孢子阴性。注： ⑴玉米粉可用糯米粉或可溶性淀粉代替,效果相同。 ⑵该培养基加入10ml/L Tween-80，制成玉米粉Tween-80琼脂，用途相同，效果更好。
真菌的分离培养及形态观察
真菌的分离培养及形态观察 真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。 目的要求 1．掌握真菌分离培养方法。 2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。 3．了解真菌载片培养法。 4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。 操作步骤 —、真菌的分离培养方法 （－）平板划线分离法 1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。 2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。 3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。 4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。 （二）稀释分离法 1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。 2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。 3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。 二．真菌培养性状观察 （一）真菌在固体培养基上的生长表现 1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色或红色等。 2. 霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2～5d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直径1～2mm或更小）。很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。 （二）真菌在液体培养基中的生长表现 1. 酵母菌注意观察其混浊度、沉淀物及表面生长性状等。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程 1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、 酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。 （1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在 小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物 拍照留用于鉴定，并做好相关记录。 （2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。 2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。 3.取样： （1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较 粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取 样本，样本不要剪的太大或太小。 （2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个 接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数， 尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。 （3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。 （4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。 4.表面灭菌：在无菌操作台中进行 （1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。 （2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管
细菌真菌放线菌培养基配方
。 细菌培养基：肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的一． 培养基,肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。 肉膏蛋白胨培养基 1.药品比例： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL， PH7.4～7.6 2.实验器材： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡
萄糖、孟加拉红、链霉素、 1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO、NaCl、K HPO·3HO、MgSO·7HO、222434 FeSO·7HO、4.5mL 无菌水6 管，10%酚液，49.5mL 无菌水( 带玻璃珠)124 瓶。土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯。电炉、高压蒸气灭菌锅、超净工作台 . 3.配置方法 （1）称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 （2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至．
所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中， 再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补 足所失的水分。 （3）调pH：检测培养基的pH，若pH 偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH 范围。若偏碱，则用lmol/L HCl 进行调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意 pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 （4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4 层纱 布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般
黄连内生真菌分离培养条件筛选
黄连内生真菌分离培养条件筛选 摘要：本试验采用压贴法通过对黄连根、茎、叶在不同次氯酸钠浓度及不同表面消毒时间的PDA培养基上的培养，选出黄连内生真菌的适宜培养条件；在获得适宜培养条件后重新培养所有部位，待其长菌后挑选菌落边缘菌丝再培养，如此反复，直到获得纯培养物为止。通过培养筛选在主根、须根、叶柄、叶片四个部位共获得了60多种菌株，并对分离出的菌株进行保种，为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。 关键词：黄连，内生真菌，分离条件，培养条件 Endophyticfungi of Coptis separation and culture conditions screening Abstract: The test select the suitable cultivation condition of endophytic fungi ,using pressure stick method cultivate roots, stems and leaves on PDA medium at different concentrations of sodium hypochlorite and different surface sterilization time.Recultivate all parts after acquising suitable cultivation,then select ege colonies and recultivate when they grow fungi,then circulate the procedure,until get pure culture.By cultivating and selecting the roots,fibrous roots,petiole and leaves, more than 60 kinds of fungi are found ,and isolated strains are breed,which is preparation for subsequent strains of identification, the determination of strains antimicrobial activity. Keywords:Coptis, Endophytic fungi, Separation conditions, Culture conditions 黄连（Coptis chinensis Franch）是我国名贵中药材之一，含有大量的异喹啉类生物碱[1]（小蘖碱、黄连碱、甲基黄连碱、小蘖红碱、药根碱、阿魏酸等）。尤其是小蘖碱对人体病原细菌和皮肤真菌[2]具有广谱的抗菌活性，在医药中被广泛应用；同样，小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌也有显著的抑制作用。Hirano, H.等用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病（BBMV）的发生[3]。 黄连的药理研究主要以小蘖碱和黄连解毒汤为重点，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）[4]、镇静作用、止泻作用、健胃作用[5]、对心脏心率[6]和心律作用等[7]。黄连及复方
真菌的培养及形态观察
题目：真菌的培养及形态观察 动物科学1204班聂孝明 20121546 指导教师：邹玲 摘要：了解酵母菌和霉菌的菌落特征及在培养基中的生长表现，还有真菌的分离培养方法和载片培养，学习真菌水浸片的制备及形态观察。本实验通过真菌的固体培养，酵母菌水浸片旳制备观察及划线分离培养的方法进行形态观察。在固体培养基上，观察到A菌落成绿色比较光滑、有分生孢子、菌丝有横隔为青霉。D菌落有大量直立菌丝并且顶部发黑、有孢子囊、菌丝无横隔为根霉。B菌落大而光滑、显微镜下菌体较大、有假菌丝并且出芽生殖的为酵母菌。 关键词：酵母菌霉菌形态观察分离培养 引言：真菌在自然界中分布广、数量大、种类多。酵母菌是单细胞微生物，细胞核和细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大10倍左右，多为圆形或卵圆形，无性繁殖为出芽生殖，可以形成假菌丝，有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色液制成水浸片可以观察期外形和区分细菌的死活。霉菌的营养体是分支的丝状体，较大，分为基内菌丝和气生菌丝，不同的霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子，细胞易收缩变形，孢子容易分散。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰，完整，保持自然状态的霉菌形态。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种：酵母菌，青霉，根霉的斜面培养菌种 1.1.2试剂：沙堡培养基、美蓝染色液、70%酒精、无菌水等 1.1.3其他：解剖针、玻片、盖玻片、接种环、显微镜等 1.2方法 1.2..1真菌的划线分离培养 培养基：将沙堡琼脂培养基融化后，冷却至45摄氏度，注入无菌平皿中，每皿15~20ml，做成平板备用。 接种：取待分离的材料少许，投入无菌水试管中，振荡，使分离菌悬浮于水中，将接种环火焰灭菌后冷却，取上述悬液，进行平板划线分离。 培养与观察：划线完毕后，置于28摄氏度温箱培养2~5天，待形成子实器官后，取单个菌落部分，制片镜检。若只有一种菌，既得纯培养物。如有杂菌可取培养物少许制成悬液，用作划线分离，有时反复多次可获得纯种。也可在放大镜下观察，用无菌镊子夹取一段分离的真菌菌丝，在平板上分离培养，即可得到真菌的纯培养物。 1.2.2真菌在固体培养基上的生长表现： 酵母菌在固体培养基上菌落呈油脂状或蜡质状，表面光滑、湿润、粘稠，有的表面呈现粉粒状，粗糙或褶皱，菌落边缘整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色、红色等。将不同的霉菌在固体培养基上培养2~5d，可见霉菌有绒毛状、絮状、绳索状等。大小依霉菌种类而异，很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。 1.2.3真菌的形态观察 1.2.3.1酵母菌水浸片的制备：将美蓝染色液或蒸馏水滴于干净的载玻片中央，用接种环以无菌及操作取培养48h的酵母菌少许，均匀涂于液滴中，染色2~3min后加盖玻片。注意切勿产生气泡，然后低倍镜和高倍镜观察其细胞形态、芽殖方式，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞。 1.2.3.2挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，震荡试管制成孢子悬液，用灭菌滴管吸取
植物内生真菌
植物内生真菌 一、内生真菌的概念 内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成的孢子（或者孢子果）不容易识别。真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。 草本植物内生真菌侵染种子内部，播种后，真菌随着幼苗的生长和植株的发育成熟而生长，这些真菌没有吸器，出现在茎、叶、花序组织，而不出现在根内，这一点与菌根真菌不同。受侵染的植株在营养生长阶段不表现出被内生真菌侵染的特点，但是，当植物开花的时候，就可以观察到浸染的真菌。 与内生真菌容易混淆的一个概念是内生菌根，菌根是高等植物的根与真菌形成的共生联合体，内生苗根是菌根当中的一种类型，内生菌根的共同特征是根的表面不产生菌套，仅有稀疏的外生菌丝，菌丝在根部皮层组织的细胞间延伸，但不产生哈蒂氏网，菌丝体可侵入细胞内部，并形成不同形状的吸器，而宿主植物的根一般无形态及颜色的变化。故内生菌根用肉眼很难识别。 二、内生真菌的一般特征 内生真菌存在于根以外的植物组织细胞，可以用显微镜观察，也可以通过纯培养把它们分离出来进行研究。分离内生真菌时要对植物组织进行表面消毒，然后切成小片放在培养基上培养3～5天，内生真菌就生长在培养基上，可根据孢子和菌丝的特征，对它们进行分类鉴定。 可以按常规方法把内生真菌从多种植物上分离出来，已经发现的内生真菌包括许多子囊菌和半知菌、一些担子菌及少量的卵菌。主要的内生真菌包括药用Chloroscypha和Lophodermium（散斑壳属）中的一些种类以及Cryptoxline、Cryptosporriopsis（拟隐孢菌属）、Phomopsis（拟茎点霉属）和 Phyllosticta（叶点霉属）中的一些种类。其中许多可以从植物组织中偶然分离到。这类真菌的共生生活方式与其占主导地位的腐生生活方式来讲，似乎是次要的。比如说，担子菌中有许多种类生长在木头上或粪堆上，但有时也可在植物细胞内发现。 苔鲜植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物中都发现有内生真菌。Petrini（1986）在对热带、温带和阿尔卑斯山地区的200多种植物调查之后发现，几乎所有生活的植物体内均有内生真菌的存在。在内生真菌中，宿主的专一性变化很大，一些真菌能够从生长在不同的生态和地理条件下的属于不同科属的多种宿主植物内分离出来，但是其它一些内生真菌仅限于某一特殊种属的几种宿主植物，仅有少数几种内生真菌专一地出现在某一种特定的植物中。 内生真菌在一些植物及农作物中广泛传播具有重要意义，农业科学家对牧草的内生真菌有特别的兴趣，因为这些真菌会产生真菌毒素，从而对动物产生毒性。此外这些真菌也有潜在的应用价值，例如利用抗、感品种的植株或器官对病原真菌毒素的敏感性反应上的差异，人们可以应用毒素进行快速、准确地鉴定大批的品种资源，一则可以直接发现抗病材料，在生产上推广应用；二则可以选出一些农艺性状虽然不太理想，但具有抗病性的材料，作为今后常规育种的亲本材料。 三、草本植物的内生真菌 l．草本植物内生真菌的形成许多草本植物的内生真菌都是属于麦角菌科（Clavicipitaceae）的真菌，其中传播最广的可能是香柱菌（Epichloe typhina），它寄生在禾本科牧草上，在70多种草坪植物中均存在，它的无性世代是半知菌类的顶孢霉属（Acremonium）。香柱菌属真菌子座淡色，平铺状，包围在禾本科植物茎和叶上，像一个套子；子囊壳理生在子座内，子囊细长，单膜；顶端加厚，具有折光性的顶帽；子囊孢子丝状，无色，有隔膜。 麦角菌属（ Claviceps）内生真菌，寄生在禾本科植物的子房内，后期在子房内形成圆形到香蕉形的黑色或白色的菌核，菌核越冬后，产生子座；子座直立，有柄，可孕头部近球形，子囊壳埋在整个可孕头部的表层内；子囊孢子无色，丝状，无隔膜。麦角菌（C．purpurea）寄生的患病植物在种子上形成紫色、弯曲的菌核，即表角；麦角内含有生
146种细菌-真菌-酵母培养基配方
146种培养基配方 ——2009年2月1日星期日by尛森蟲1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(青虫菌)、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌(大肠杆菌)、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O0.1ｇ Na2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the li quid , then autoclave at 121℃for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml Distilled water (蒸馏水) 900ml pH 7.0 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌)、嗜热乳酸链球菌 6. Lactic-bacteria Midium Ⅱ(乳酸菌培养基Ⅱ) Lacto-casein peptone (乳酪蛋白胨) 10g Beef extract (蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 5g Tween (吐温) 80 1g K2HPO4 2g Na-acetate (醋酸钠) 5g Diamine citrate (柠檬酸二胺) 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water (蒸馏水) 1000m pH 6.5-6.8 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌) 7. Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY (蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基)
真菌的分离及常用培养基
真菌的分离及常用培养基 关键词：真菌抗生素念珠菌白假丝酵母菌北纳创联北京标准物质网 医学真菌形态学观察是认识真菌的第一步，但仅通过光学显微镜对其进行观察并不能直接鉴定为真菌，需要对疑似相关病变部位的标本进行采集及分离，然后在合适的培养基进行培养。 一、病变部位标本的采集分离 通常采集疑似病变部位的皮肤附属物、分泌物、血液、痰液、脑脊液等体液，注意标本的新鲜度、无菌性、充足性，而且要对所采集标本进行正确消毒，杀死其中混有的杂菌。标本为脑脊液时，需进行离心，收集沉淀物进行培养，标本为血液时，需要先行增菌培养后再分离，这样可增加阳性率，未增菌培养的阴性结果并不能排除阳性结果。 二、真菌培养常用的培养基 目前商品化的真菌培养基多为干燥脱水的形式，可以按照配制说明书进行配制，值得注意的是，使用后的装培养基的瓶盖须拧严，防止受潮，以各下次使用。 1.沙保弱培养基及含抗生素的沙保弱培养基沙保弱培养基是培养真菌最常用的培养基，绝大多数的真菌均可以在其上生长，沙保弱培养基还可以添加抗生素，从而抑制多数细菌和污染真菌的生长速度。含抗生素的沙保弱培养基多用于皮肤癣菌和绝大多数致病真菌的分离和培养，但值得注意的是含有抗生素的培养基会抑制念珠菌属、隐球菌和少量丝状真菌的生长。 2.玉米粉（厚膜孢子）培养基多用于鉴别念珠菌属，培养基中的吐温可以促进白假丝酵母菌产生厚膜孢子，同时可以加入1％葡萄糖促进红色毛霉菌生长，并抑制须毛霉菌的生长。 3.土豆葡萄糖培养基土豆培养基中需将土豆切成小于1cm。的小块，常用于诱导真菌形成孢子或产生色素。 4.脑-心浸液琼脂培养基是一类营养丰富的真菌培养基，人工配制过程较为烦琐，一般通过商品化的培养基按照说明书进行配制。BHI多用于室温培养致病真菌，也可用于35～37℃培养致病真菌的酵母相。
植物内生真菌的分离
植物内生真菌的分离 一、实验目的 1．理解内生真菌存在的普遍性和多样性 2.掌握常规的微生物分离纯化方法 3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能 二、实验原理 植物内生真菌( Ｅnｄophｙte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系,因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。 采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌 三、实验材料 板蓝根新鲜健康的叶片 试剂:次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素 培养基：PDA培养基、分离培养基 四、实验步骤 （一)、配制PDA培养基 10月27号晚上：
(1）配置ＰDA培养基,用电子称称取去皮的土豆10０g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热,加入琼脂７.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至5０0毫升。 (2)准备1０瓶无菌水，每瓶150ml左右。 (3)包好烧杯,培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。 (二)、配制分离培养基 28号中午： （1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用,另一份待高温灭菌后,加入青霉素１0０mg／L、链霉素200mg/L的混合液20mｌ，即得到分离培养基。 （2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板,注意在整个过程中保证无菌操作。 (三)、采集新鲜板蓝根叶片 ２8号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。(四)、植物组织表面消毒 2８号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段(片）做如下表面消毒处理:75%酒精漂洗3ｍin，无菌水冲洗4~5次,5％次氯酸钠溶液漂洗叶3ｍin,无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。 （五）、接种并培养 28号晚上: (1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.５ｃm 2 小块,放入含
川芎内生真菌的分离与鉴定
川芎内生真菌的分离与鉴定 汪杨丽，严铸云，郭晓恒，宋杰，陈新，万德光 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075） E-mail：wangyangli27@https://www.360docs.net/doc/ce4589008.html, 摘要：目的：探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。方法：采用平板分离法分离川芎的内生真菌，采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。结果：从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株，经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。结论：不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。 关键词：川芎，内生真菌，分离鉴定 川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，是著名的川产道地药材。四川都江、彭州为川芎的主要产区。此外，云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产，分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1～3]。有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4]，但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5，6]，本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离，探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1植物来源（见表1） 1.1.2 培养基 PDA培养基[7]（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液[8]（用于分离）；PDA 培养基；促孢培养基（KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15～20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。 表1 各种川芎的样品情况 药材名原植物部位采集地采集时间 川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20 川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10 西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14 云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注：以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定 1.2方法 1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根，用自来水将川芎根茎表面洗净，用5%的NaClO溶液浸泡5min，用自来水反复的漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内，每个培养皿中放7小块，每个样品6个培养皿，置28℃恒温箱中培养3～15d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定 一、采样 地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛 用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套 采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化 二、培养基： （1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。 （2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。 （均需要加入抗生素100μg/ml） 产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。 1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。 0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓 0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。 刚果红染液：2% 刚果红溶液。 NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。 三、实验方法 3.1 真菌菌株的分离 取土样方法如前所述。取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。培养5-7d后用刚果红染色、NaCl脱色后筛选菌落周围有明显透
真菌培养常用培养基
[沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂，沙堡弱培养基，SDA] （一）组成 葡萄糖40.0g 蛋白胨10.0g 琼脂12.0～15.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后加入200mg氯霉素，121摄氏度10分钟灭菌后备用。（三）目的 是常用的分离或保存菌种的培养基。 [沙氏液基，SDB] （一）组成 葡萄糖40.0g 蛋白胨10.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后加入200mg氯霉素，121摄氏度10分钟灭菌后备用。[加抗生素沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂基，SDA with antibiotic] （一）组成 葡萄糖40.0g 蛋白胨10.0g 琼脂12.0～15.0g
蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后加入200mg氯霉素。250mg放线菌酮，121摄氏度10分钟灭菌后备用。[改良沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂基，modified SDA] （一）组成 葡萄糖20.0g 蛋白胨10.0g 琼脂12.0～15.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后121摄氏度10分钟灭菌后备用。 （三）目的 保存菌种培养基。 [马铃薯葡萄糖琼脂，PDA] （一）组成 马铃薯200.0g 葡萄糖20.0g 琼脂12.0～15.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 先将马铃薯洗净去皮切片，加水180ml，煮沸30分钟后过滤，再加葡萄糖、琼脂，将过滤
液补足到1000ml，121摄氏度灭菌后备用。 （三）用途 此培养基是培养真菌较好的培养基，同时也是鉴定真菌较好的培养基之一。鉴定皮肤癣菌一般不用此培养基。 [玉米吐温80琼脂，CMA with T w80] （一）组成 玉米粉40.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000ml 吐温80 10ml （二）制法 先将玉米粉混于水中，65摄氏度水浴一小时，过滤，再补足水量，然后加入琼脂和吐温80，121摄氏度10分钟灭菌后备用。 （三）用途 用于观察白念珠菌厚壁孢子及假菌丝；红色毛癣菌在此培养基产色素较好。 [米饭培养基rice grain medium] (一)组成 大米300.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 将3g大米放入试管中，加入10ml蒸馏水，高压121摄氏度10分钟灭菌后备用。
真菌学实验指导
本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8
实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻
常见真菌的分离与鉴定
常见真菌的分离与鉴定 发表时间：2010-08-20 发表者：皮肤科 (访问人次：361) 作者：上海长征医院皮肤科徐红 2005年6月13～19日全国各地举行了第8届中国护足周，主题是“积极治疗足病，杜绝家庭传染”。 在中国,每2个人中就有1人罹患足病，其中成年人发病比例高达75%；超过60%的足病为真菌感染，其中足癣发病率为45.2%，甲真菌病(俗称甲癣)占15.5%；40%的足癣患者是被家人传染的；在真菌患者中只有23.8%寻求治疗，其中50%的患者症状稍有好转就不继续治疗。 真菌其实很常见，真菌就生活在我们身边。 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由 孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状， 称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交 织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子