双元表达载体系统
petduet1 pacycduet 原理
Petduet1和pacycduet是两种常用的双元表达系统，用于原核和真核表达重组蛋白。
它们都包含了两个不同的多克隆位点，可以用于插入感兴趣的基因并进行表达。
Petduet1使用了T7和lacUV5启动子，pacycduet则使用了T7和CMV启动子。
以下是关于这两种系统的详细介绍：Petduet1和pacycduet系统的结构Petduet1和pacycduet系统的DNA载体结构大体相似，都包括了多个重要元件：双选择标记位点（Ampicillin和Chloramphenicol）、启动子（T7和lacUV5/CMV）、His标签、HA标签、TEV位点、定向载体和复制起点等。
Petduet1由5429bp长的质粒构成，其中含有lacIq基因的启动子和T7启动子，并通过MCS1和MCS2多克隆位点构建了重组基因组成，方便插入两个不同的重组蛋白基因。
Petduet1还包含了His标签和HA标签，对于蛋白的纯化和检测非常有帮助。
Pacycduet的质粒长度为5726bp，包含了Ampicillin和Chloramphenicol的双选择标记位点，T7和CMV的启动子，His标签和HA标签。
与Petduet1类似，pacycduet也有MCS1和MCS2多克隆位点，方便插入两个感兴趣的基因。
pacycduet还包含了TEV位点，方便进行蛋白纯化和切割。
Petduet1和pacycduet系统的应用这两种双元表达系统可以广泛应用于原核和真核系统中，用于表达多种蛋白。
研究表明，它们不仅可以同时表达两个重组蛋白，而且还可以在同一细胞中进行蛋白融合。
在原核表达系统中，Petduet1和pacycduet系统可以在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，提供了一种简单、快速的蛋白制备方法。
而在真核表达系统中，它们同样可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，为疾病治疗和生物医药领域提供了重要的工具。
总结Petduet1和pacycduet是两种常用的双元表达系统，具有结构简单、应用广泛的特点。
克隆载体与表达载体
染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体
其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。
人工染色体载体拷贝数少，制备困难，通常采取“穿梭载体”的策略来解决
含有质粒载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点，这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制，含有第二受体(如酵母)端粒(TEL)、DNA复制起始位点(ARS)和着丝粒(CEN)以及合适的选择标记。载体在体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子一般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型。
克隆载体
基本性质
基本特征（或载体的构建）
原理机制
常用的载体
克隆载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）
（1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
M13噬菌体产生单双链DNA的机制）
LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点
一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗菌素选择原理）
双元载体的运行原理
双元载体的运行原理【知识文章】双元载体的运行原理1. 引言双元载体是一种重要的科学概念，它在许多领域中有着广泛的应用。
它的运行原理是我们理解双元载体的关键。
本文将深入探讨双元载体的运行原理，以帮助读者更好地理解该概念。
2. 双元载体的定义和基本概念在讨论双元载体的运行原理之前，首先需要了解其基本定义和概念。
双元载体是指具有两种截然不同特性的物质，可以在其内部同时存在并进行相互作用。
其中一种特性通常用来传递信息或能量，而另一种特性则起到支持和稳定的作用。
3. 双元载体的运行原理之深度和广度评估深度评估是对双元载体运行原理的内部机制进行全面而深入的研究。
广度评估则是对双元载体在不同领域和应用中的广泛性进行考察。
通过深度和广度评估，我们可以获得对双元载体运行原理的更全面而深刻的理解。
4. 双元载体的内部机制双元载体的运行原理可以通过其内部机制来解释。
一种常见的双元载体是半导体，其中一种特性是传导电子的能力，而另一种特性是创建一个禁带，以控制电流的流动。
传输信息的载体是电子，在半导体材料中通过禁带来实现对电子的控制和传输。
这种内部机制是双元载体运行的基础。
5. 双元载体的应用双元载体在许多领域中都有广泛的应用。
在电子技术领域，双元载体是构建集成电路的重要组成部分，通过控制电子的传导和禁带来实现信息的传输和处理。
在光电子学领域，双元载体则用于光电转换和传感器技术。
双元载体还在材料科学、生物医学、能源等领域中得到广泛应用。
6. 双元载体的优势和挑战虽然双元载体具有广泛的应用前景，但也面临着一些挑战。
双元载体的制备过程和性能控制是一个复杂的问题，需要满足高度纯净度和精确的结构要求。
双元载体的性能受到外界环境的影响，如温度、湿度等。
对双元载体的优化和稳定性改进是未来的研究重点。
7. 总结和展望双元载体作为一种重要的科学概念，在许多领域中都起到了重要的作用。
对其运行原理的深入理解可以帮助我们更好地应用和开发双元载体的潜力。
基因工程 载体构建
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Oligo DNA的Tm值 引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度，碱基组成， 引物使用缓冲的离子强度也有关。长度为25mer以下的引物， Tm计算公式为： Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃，一般采 用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。兼并碱基Tm值可 以折算。 酶切位点和保护碱基不计算在内，而只计算与模板互补的 碱基序列的Tm。
Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白 表达系统。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚 克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。当基 因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确 的方向和阅读框。Gateway™也有助于进行带不同数目纯化 和检测标签的表达 。 Gateway™利用了位点特异重组， 所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接 酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移 您感兴趣的基因到Gateway™改造过的 的各种表达载体（目 的载体）。
根癌农杆菌（Ti质粒）
Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子， Ti质粒具有五个主要功能区域，它们分别是 T-DNA、质粒转移(plasmid transfer)、冠瘿 碱代谢(opine catabolism)、复制原点(ori)和 毒性区域(vir)。 T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色 体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交 界处的25bp不完全直接重复(imperfect direct repeats)，右端的序列称为右界(right border, RB), 左端的为左界(left border,LB)。 T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以 将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后， 将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA 仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物 基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。
双元载体的工作原理
双元载体的工作原理
双元载体是一种智能材料，它具有双重功能，能够在不同环境条件下实现不同的工作原理。
这种材料通常由两种或更多种不同的组分组成，每一种组分都对应一种工作模式。
双元载体的工作原理基于其组分之间的相互作用。
一种常见的双元载体是由磁性材料和热敏材料组成。
在低温下，磁性材料的磁性强，可以用于磁性存储等领域；而在高温下，磁性材料的磁性会减弱，此时热敏材料的性能会被激活，可以用于温度传感器等应用。
双元载体的工作原理还可以通过电场、光照、压力等外部条件来实现切换。
例如，一种由铁电材料和光敏材料组成的双元载体，可以通过外加电场来实现铁电材料的极化，从而改变其电学性质；同时，当受到光照时，光敏材料会被激活，其光电性能会发生变化。
双元载体的工作原理基于材料之间的相互作用和相变。
通过调控外部条件或刺激，可以使其中一种材料起主导作用，从而实现不同的功能和性能。
这种智能材料的应用潜力巨大，可以在各种领域中发挥作用，如传感器、储能器件、智能显示器等。
总之，双元载体的工作原理是基于不同材料之间的相互作用和相变，
通过调控外部条件实现不同功能和性能。
这些智能材料的应用前景广阔，有望为各个领域带来革命性的发展。
载体构建
水稻中cdc2超表达载体的构建生物技术专业 吴娇娇指导教师： 傅体华教授 寿惠霞教授摘要：每个细胞都是一个细胞周期的产物。
细胞增殖是由一系列细胞分裂调控机制精确控制的，在此过程中细胞周期蛋白依赖性激酶起着关键作用。
由p34cdc2和细胞周期蛋白组成的复合物在真核生物中被称为有丝分裂启动子（MPF），控制从G1到S期的转变，而目前通过转基因的材料来研究水稻中cdc2的报道比较少。
为了了解细胞分裂调控基因cdc2在水稻中的作用，通过基因芯片我们得到了一个水稻的cdc2同源基因，期望通过对其超表达得到一些水稻中细胞周期调控的信息。
在此我们选择了包含玉米泛素ubi启动子的双元载体pCAMBIA1390-ubiquitin作为超表达载体，该载体可以在大肠杆菌和农杆菌中稳定表达。
之后我们将最终载体通过电击转化进入强毒力农杆菌强毒力菌株EHA105，保菌。
经典的构建载体的构成就是一系列是酶切和连接反应，因此如何能够高效的进行酶切和连接反应就成为提高构建效率的关键。
在实验中我们也积累了一些经验，同时也改进了一些方法以提高效率。
关键词：细胞分裂调控基因2；细胞周期蛋白；超表达；双元载体Construction of overexpressing vector for rice cdc2 geneBiotechnology Wu JiaojiaoAcademic advisor Shou HuixiaAbstract：Every cell in life is the production of cell division which is controlled by a serial precise reaction. Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) play an important role in regulating the eukaryotic cell cycle. A key element of cell cycle control in eukaryotes is the M-phase kinase, composed of p34cdc2 and cyclin A. To dissect the plant cell cycle, we have previously got a cdc2 (cell division control) gene which is homologous to Arabidopsis thaliana from Oryza sativa through DNA chips, We have cloned it into a overexpressing vector termed pCAMBIA1390-ubiqiutin using ubi as promoter which can express efficiently in E.coli and Agrobacterium, then it could be transformed into rice callus. So the target gene is tightly linked to a strong constitutive promoter from Maize, which can over express cdc2. In this study, it is found that digestion and ligation are the key steps in the construction of vector. Some questions in experiment were found and discussed in this paper.Key words:cdc2；cyclin；overexpression；binary Ti vector细胞周期的进程是通过细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）的活性变化来控制的。
(完整word版)基因表达载体构建
一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。
1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：（1）结构基因均有调控序列；（2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。
2．不同点：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：（1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。
其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。
否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。
（2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。
（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。
二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。
2．主要环节：（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。
植物表达载体构建
（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆 载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因； 表达载体是适于在受体细胞中表达外源基 因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而 能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多 数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序 列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动 子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且 无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子， 其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合 基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组 织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基 因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用 于各种不同的转化目的。
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
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病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进 行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转 化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表 达和功能的实现
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Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
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第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
含子、信号肽等）连接在一起构成基因。
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启动子
Ti质粒
Nos（胭脂碱合成酶基因）、Ocs（章鱼碱合成酶基因）等
基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植 物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建 嵌合基因的启动子。
双元表达载体系统
双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。
之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。
双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。
原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。
另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。
通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。
然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。
我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
Ti质粒介导的二元整合转化系统
双元表达载体系统主要包括两个部分:
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T-DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA(T-DNA)两端24bp 序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。
之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T-DNA的转移。
另一部分则是含有T-DNA的微型质粒，它带有目的基因和大肠杆菌及农杆菌复制的起始位点，实际上是一种分子质量较小的大肠杆菌和农杆菌的穿梭载体。
双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA 的转移。
克隆载体与表达载体
克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。
② IG区内只有一个Bsu I 切点。
（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。
M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。
而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。
能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。
cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。
黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。
克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。
质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。
双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化
双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【摘要】【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。
【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPTⅡ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种＂优引三号＂,对所获得的转基因植株进行PCR检验。
【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。
【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。
%【Objective】The study was done to construct a binary expression vector to improve stress-tolerance of target plants by genetic transformation.【Method】 We introduced HaBADH directly into plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS,and replaced NPTⅡ with HaCMO,and constructed a binary expression vector.HaBADH and HaCMO were both cloned by our laboratory and pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO was transformed into rice Youyin-3 by Agrobacterium-mediated transformation and transgenatic plants were detected with PCR.【Result】 We constructed the plant binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO successfully,and obtained 5 transgenic rice plants which contained the vector by PCRanalysis.【Conclusion】 This study introduces HaBADH and HaCMO to pCAMBIA2300-35S-OCS,and constructs a binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,and transforms it to rice,which prepares for study synthesis and accumulation of glycine betaine in transgenetic rice.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【总页数】8页(P210-216,223)【关键词】梭梭;甜菜碱醛脱氢酶;胆碱单加氧酶【作者】石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【作者单位】宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002 宁夏大学生命科学学院,宁夏银川750021;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002【正文语种】中文【中图分类】Q782在盐渍、干旱等渗透胁迫情况下，许多高等植物会在细胞内大量合成并积累一些有机渗透调节物质，如山梨醇、甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等，以提高自身抵抗盐渍、干旱等胁迫的能力。
双元表达载体系统
双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。
之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。
双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。
原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。
另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。
通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。
然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。
我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
山西农业大学植物基因组工程 (农学)期末划重点复习资料
1.植物基因工程（plant genetic engineering）：利用基因工程理论技术，从供体分离克隆的外源基因，在体外与DNA重组后，经遗传转化导入受体植物基因组中，并获得有效表达及稳定遗传的工程。
2.转基因植物（genetically modified plants，GMP）：通过基因工程技术改变基因组构成的植物。
该植物如是农作物，即称为转基因作物（genetically modified crops，GMC）。
3.转基因生物（genetically modified organisims，GMO）：是广义的，泛指转基因动物、植物和微生物。
（1.2.3选择性的考名词解释）补充:1 向持久广谱性抗虫病虫害方向发展。
2非生物性抗逆转基因方兴未艾。
3更注重作物品质改良。
4植物医药基因工程。
植物基因工程发展前景：1)向持久广谱抗病虫害方向发展；2)非生物性抗逆转基因方兴未艾；3)更注重作物品质改良；4)植物医药基因工程。
植物基因工程发展历程？5.基因（gene）基因组(genome):一个物种单倍体染色体数目称为该物种的基因组。
基因组学(genomics)后基因组学(post-genomics)C-值（C-value）:一个单倍体基因组的DNA含量是恒定的，称为C-值（C-value）(选择性的考名词解释)6.线粒体基因组（mtDNA）的结构特点:①独立于和染色体外，环状双链DNA或线状DNA；②在细胞内拷贝数不同，且长度随不同物种差异有明显变化；③非均一性；④由复合操纵子结构组成，多顺反子；⑤易发生变异，变异率高于cpDNA和nDNA，且缺乏修复能力；⑥mtDNA基因表达调控序列基本与原核生物相同，但有自身的特异性；⑦mtDNA能自我复制，且只有一个复制点；⑧mtDNA的浮力密度一般在1.705~1.706g/cm3植物细胞核基因组的结构特点：:①由多条染色体组成，每条染色体由DNA分子与蛋白质稳定地结合成染色质的多级结构并储存于细胞核内；②在不同物种间，遗传物质含量差异大；③没有操纵子结构，但有许多结构相似，功能相关的基因组成基因家族（gene family④存在大量不编码序列；⑤不连续基因/割裂基因；⑥单顺反子（monocistron）；⑦多复制子（multi-replicon）；⑧核基因组的遗传特点完全遵循孟德尔规律。
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双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。
之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。
双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。
原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。
另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。
通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。
然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。
我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
4.另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。
5.双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的ir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。
6.外源DNA克隆到微型Ti质粒T－DNA左右边界序列之间双元载体标签:植物双元表达载体根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤细菌，能够通过感染植物的伤口，将其Ti质粒上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA转移并整合至植物受体的基因组中。
Ti质粒中的2个独立的区域决定DNA转移及整合：T-DNA区(transferredDNA)和vir区(virlence region)。
基于Ti质粒这个结构特点，1983年Hoekema等提出双元载体策略：将去除致瘤基因的T-DNA区从Ti质粒中分离，放置在一个能在农杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒中。
这个穿梭载体称为双元Ti载体。
vir区则存在于一个已经除去T-DNA的Ti质粒中，在农杆菌中作为辅助质粒，通过反式激活使T-DNA转移到植物细胞基因组中。
由于双元Ti载体的体积小而非常便于基因克隆操作，所以逐渐取代了其它形式的Ti载体，已成为植物基因工程中最重要的植物转化载体。
(1))病毒载体系统:植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。
以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源荃因整合到植物细胞基因组中。
植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。
但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。
作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。
目前己有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中:包括椰菜叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、更豆花叶病毒(CPMV)和马铃薯X病毒(PVX)等。
其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。
(2)农杆菌质粒载体系统:质粒载体系统中最常用的质粒有:Ti质粒和Ri质粒。
r质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumcfaciens )中，Ri质粒存在于发根农杆菌(Agxobac[erium tlhixogenis)中。
r质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有荃本一致的特性。
但实际工作中，绝大部分采用五质粒。
农杆菌质粒是一种能实现DNA 转移和整合的天然系统。
r质粒有两个区域:T -DNA区〔是质粒上能够转移整合入植物受体墓因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘦瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域)和Vir区(编码能够实现TDNA转移的蛋白)。
TDNA长度为12一24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的TDNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的 TDNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
Vir区位于TDNA 以外的一个 35kb内，其产物对TDNA的转移及整合必不可少。
农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达。
Vir产物能诱导Ti质粒产生一条新的TDNA单链分子。
此单链分子从五质粒上脱离后，可以与场r产物VIRD2 蛋白共价结合，并在V [RD4和V IRE等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。
由于野生型Ti质粒过于庞大，约200一S00kb，为了便于重组DNA操作，研究人员对Ti 质粒进行了改造从而构建一系列合适的Ti衍生载体。
首先除掉了野生型Ti质粒TDNA 区的一段DNA片段。
例如:参与植物生长素和细胞分裂素的基因(这些基因过度表达植物激素，从而破坏受体细胞和激素产量)。
此外需在T质粒上加上E. Coli复制起始位点，使得插入外源基因的r质粒在为一个穿梭载体，不但可在农杆菌中复制，而且便于在E. Coli 中重组操作与保存。
3甲植物转化载体系统(包括一元载体系统和双元载体系统)。
人们在研究中发现在T -DNA转移过程中，明r基因并不一定与T -DNA位于同一个质粒上，于是通过构建中间载体解决了T质粒不能直接导入目的基因的困难。
大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性，因此研究者可以将T -DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的Ti质粒上。
这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T -DNA引入Ti质粒的有效方法。
带有重组TDNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“中间载体”(intermediate 4wtor),而接受中间费休的Ti质粒则森为等休T质粒( aevenfor T nlasmid ) .一船早知甲费体或称“缴械”载体。
在这种omc-载体中已经缺失的T DNA部分被大肠杆菌的一种常用质粒 pBR322取代。
这样任何适合于克隆在pBR322质粒的外源DNA片段都可以与pBR322质粒DNA 同源重组，而被其整合到one一Ti质粒载体上。
中间载体通常是多拷贝的B. coli小质粒，这一点对下通过体外操作导入外源基因是非常必要的。
从结构特点看可分为两类中间载体:即共整合系统中间载体和双元系统中间载体。
根据两类中间载体，目前己开发出两类转化体系:一类是一元载体系统(整合载体系统)，这一类载体系统由一个共整合系统中问表达载体与改造后的受体卫质粒组成。
在农杆菌内，通过同源重组将外源基因整合到修饰过的TDNA上，形成可穿梭的共整合载体，在Vir基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。
但这类方法构建困难，整合体形成率低，一般不常用。
另一类转化体系是双元载体系统，它由两个分别含有TDNA和Vir区的相容性突变Ti 质粒即:微型r质粒(mini一plasmid)和辅助Ti质粒(helper Ti plastnid)构成，TDNA 和Vir 基因在两个独立的质粒上，通过反式激活TDNA转移到植物细胞基因组内。
微型Ti 质粒就是含有TDNA边界缺失Vir基因的r质粒，为一个广谱质粒。
它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点(oriv)，同时具有选择性标记基因。
辅助质粒为含有Vir区段但 TDNA缺失的突变型质粒，完全丧失了致瘤的功能。
因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。
其作用是提供Vr基因功能。
激活处于反式位置上的TDNA转移。
将微型质位转入到含有辅助性Ti质粒农杆菌的途径有两条:一条是直接用纯化的微型Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞;另一条途径是采用三亲交配方法，三亲交配由含微型Ti质粒的E. Coli,含有助动质粒pRK2013的E.Cali和含有辅助Ti质粒的农杆菌组成。
三细菌混合后产生菌问的接合转导。
pRK2013可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型Ti质粒的E. Coli后，可促进微型Ti质粒一起或分别转移入农杆菌中。
但由于 pRK2013的“自杀”特性，最终在农杆菌中剩下微型Ti质粒和Ti质粒双元载体，此农杆菌可直接用于植物细胞转化。
双元载体不需经过两个载体的共整合过程。
因此构建的操作过程比较简单:由于微型Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，且构建的频率较高。
另外，双元载体在外源摹因的植物转化中效率高于一元载体。
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