病毒的分离鉴定ppt课件
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13
1．反转录PCR
Trans反转录酶系列
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反 转 录 PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 是 一种简单、快捷地对RNA进行定 性、定量分析的方法。它是以 mRNA为模板，体外扩增cDNA， 再以cDNA为模板进行特定基因转 录产物的PCR扩增。RT-PCR技术 一般用于RNA的定性分析；如果 设置阳性参照，则可对待测RNA 样品进行半定量分析。
9
（三）病毒分子生物学鉴定
阳性分离物上清 提取总RNA
反转录合成cDNA
PCR扩增 直接测序或克隆测序
10
什么是聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列
✓缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差
异；
实验动物的观察：
接种途径：
动物的发育、活动力、食欲和粪便
•脑内接种 •皮下接种
特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、 瘫痪、抽搐等直至死亡
•皮内接种
有些实验还需测量动物的体温和体重
•腹腔接种
•肌肉接种
•静脉接种
3
2．组织培养
4
细胞病变 （CPE ）：
1、分布均匀的小 颗粒状破坏病变； 2、局灶状小颗粒 状破坏； 3、细胞圆化，呈 局灶性葡萄状的堆 积； 4、细胞融合。
圆缩；
脱落；
聚集；
破碎；
5
3．鸡胚培养
4．蚊虫分离病毒法
优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便；
缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；
（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标
1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变
➢组织培养分离法： ✓没有隐性感染 ✓没有免疫能力的抵抗力 ✓接种量大 ✓培养条件易于控制 ✓加速病毒的分离过程
汉坦病毒敏感பைடு நூலகம்培养细胞 首先发现人肺癌细胞（A549） 其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等
7
二、病毒的鉴定
（一）病毒的数量与感染性测定
1）蚀斑（plaque）测定
可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）
2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定
结
中
晶
性
紫
红
染
染
色
色
8
（二）病毒理化性质及血清学鉴定
1）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定 ELISA；IFA；
➢ 该方法适合对待测样品进行初步 筛选，目前已广泛被实时定量 PCR替代。
14
2．实时定量PCR
SYBR Green
➢ 常用于mRNA的定量分析
➢实 时 定 量 PCR (Real-time
实
Quantitative Polymerase chain
时 定
量
Reaction,RQ-PCR) 是 定 量 分
PCR
分
析mRNA的最通用、最快速、
析 原
理
最简便的方法，该方法是对
示 意
图
PCR反应进行实时监测，具有
很高的灵敏度和特异性。
15
*目前有5种技术用于实时定量PCR
其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加；
其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的 TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法， 它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的 需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定， 但是成本较高。
病毒分离鉴定与 常用序列分析软件简介
1
一、病毒的分离
➢ 标本的处理 ➢ 病毒的分离
蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒
“全程冷链”
2
1．动物接种
➢动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）
✓优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离；
生非特异条带；
6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 ℃维持
5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双 链。
12
PCR的各种变体
反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 多重PCR 荧光定量PCR（Q-PCR） 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RTPCR） 巢式PCR（NEST PCR） 递减PCR（Touchdown PCR）
16
3.DNA芯片技术
DNA芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡 核苷酸或DNA探针，与待测 荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比 较和分析，得出样品的遗传 信息(基因序列及表达)； 亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。
3、引物延伸（Primer elongation）：引物延伸
一般在72 ℃进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩 增片段长短而定；
4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足
已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶 活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；
5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产
的相互作用。
11
PCR操作过程
PCR技术的工作原理
1、预变性（Initial denaturation）： 模板DNA
完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5 分钟；
2、引物退火（Primer annealing）：退火温度一
般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有 较大影响；
经口感染 胸腔接种
优点：病毒可长时间保存在蚊体内； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大；
缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；
6
强调点：实验室生物安全
实验室安全是重中之重，如果实验室的条 件不具备，建议不要开展病毒分离工作；
在进行相关实验的时候一定要严格按步骤 操作；
实验过程中一定要做好严格防护。
1．反转录PCR
Trans反转录酶系列
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反 转 录 PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 是 一种简单、快捷地对RNA进行定 性、定量分析的方法。它是以 mRNA为模板，体外扩增cDNA， 再以cDNA为模板进行特定基因转 录产物的PCR扩增。RT-PCR技术 一般用于RNA的定性分析；如果 设置阳性参照，则可对待测RNA 样品进行半定量分析。
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（三）病毒分子生物学鉴定
阳性分离物上清 提取总RNA
反转录合成cDNA
PCR扩增 直接测序或克隆测序
10
什么是聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列
✓缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差
异；
实验动物的观察：
接种途径：
动物的发育、活动力、食欲和粪便
•脑内接种 •皮下接种
特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、 瘫痪、抽搐等直至死亡
•皮内接种
有些实验还需测量动物的体温和体重
•腹腔接种
•肌肉接种
•静脉接种
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2．组织培养
4
细胞病变 （CPE ）：
1、分布均匀的小 颗粒状破坏病变； 2、局灶状小颗粒 状破坏； 3、细胞圆化，呈 局灶性葡萄状的堆 积； 4、细胞融合。
圆缩；
脱落；
聚集；
破碎；
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3．鸡胚培养
4．蚊虫分离病毒法
优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便；
缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；
（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标
1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变
➢组织培养分离法： ✓没有隐性感染 ✓没有免疫能力的抵抗力 ✓接种量大 ✓培养条件易于控制 ✓加速病毒的分离过程
汉坦病毒敏感பைடு நூலகம்培养细胞 首先发现人肺癌细胞（A549） 其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等
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二、病毒的鉴定
（一）病毒的数量与感染性测定
1）蚀斑（plaque）测定
可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）
2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定
结
中
晶
性
紫
红
染
染
色
色
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（二）病毒理化性质及血清学鉴定
1）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定 ELISA；IFA；
➢ 该方法适合对待测样品进行初步 筛选，目前已广泛被实时定量 PCR替代。
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2．实时定量PCR
SYBR Green
➢ 常用于mRNA的定量分析
➢实 时 定 量 PCR (Real-time
实
Quantitative Polymerase chain
时 定
量
Reaction,RQ-PCR) 是 定 量 分
PCR
分
析mRNA的最通用、最快速、
析 原
理
最简便的方法，该方法是对
示 意
图
PCR反应进行实时监测，具有
很高的灵敏度和特异性。
15
*目前有5种技术用于实时定量PCR
其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加；
其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的 TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法， 它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的 需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定， 但是成本较高。
病毒分离鉴定与 常用序列分析软件简介
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一、病毒的分离
➢ 标本的处理 ➢ 病毒的分离
蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒
“全程冷链”
2
1．动物接种
➢动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）
✓优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离；
生非特异条带；
6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 ℃维持
5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双 链。
12
PCR的各种变体
反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 多重PCR 荧光定量PCR（Q-PCR） 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RTPCR） 巢式PCR（NEST PCR） 递减PCR（Touchdown PCR）
16
3.DNA芯片技术
DNA芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡 核苷酸或DNA探针，与待测 荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比 较和分析，得出样品的遗传 信息(基因序列及表达)； 亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。
3、引物延伸（Primer elongation）：引物延伸
一般在72 ℃进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩 增片段长短而定；
4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足
已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶 活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；
5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产
的相互作用。
11
PCR操作过程
PCR技术的工作原理
1、预变性（Initial denaturation）： 模板DNA
完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5 分钟；
2、引物退火（Primer annealing）：退火温度一
般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有 较大影响；
经口感染 胸腔接种
优点：病毒可长时间保存在蚊体内； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大；
缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；
6
强调点：实验室生物安全
实验室安全是重中之重，如果实验室的条 件不具备，建议不要开展病毒分离工作；
在进行相关实验的时候一定要严格按步骤 操作；
实验过程中一定要做好严格防护。