S实验九植物单细胞分离技术(理论)

实验九植物单细胞分离技术（理论）

一、植物细胞培养概述

指以单细胞（single cell）或细胞团（cell aggregate）为单位进行的植物组织培养方式。

1、技术特点：

◆操作简单◆试验重复性好◆单次实验群体大

2、培养的植物细胞的特点

A、培养时生长速度慢

B、直径为20 ~ 150um，比细菌大

C、纤维素细胞壁非常脆弱

D、生理与代谢活性低

E、需求营养成分复杂

F、不易于保存

G、次生物质的合成与积累和细胞分化过程有关

3、细胞培养液的性质

◆培养液具有一定的黏度◆提供细胞生长发育所需的营养

◆黏度随细胞浓度的增加而增大◆需不停搅拌而进行通气二、植物细胞悬浮培养

（一）悬浮细胞培养的优点

A、提供大量的均匀的植物细胞

B、细胞增殖速度比愈伤组织快

C、适宜大规模培养

D、增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应

E、避免有害物质的过分积累

F、保证氧的充分供给

（二）悬浮培养细胞的建立与测定

1、诱导建立

诱导细胞悬浮培养的方法

A、选择一块易破碎的愈伤组织，转移到适合的培养液中，经1~2个周期振荡培养，得到呈分散状的细胞培养物。

B、选择有用的培养材料，进行匀浆处理，过滤，转入液体培养基中培养。

C、选择有用的材料多次转移与液体振荡培养，得到分散程度高的细胞。

悬浮培养的材料：

愈伤组织的疏松程度、分散效果的好坏。

2、生长与增殖

扩增曲线：

◆S形◆延迟期、对数生长期、平台期、衰减期

悬浮培养细胞起始浓度：

◆一般在0.5 ×105~2.5 ×105个/ml ◆悬浮培养的单个细胞，3~5d 可见分裂状况

3、悬浮培养物的保持

A、培养瓶

◆100ml或250ml的三角瓶作容器◆装20ml或50ml的培养液

B、振荡培养装置

◆旋转式摇床◆转速控制在120r/min以下◆体积不宜过大，温度可调

C、继代培养

◆定期继代培养，最适周期为1~2周◆继代时间为1周的可用1：4的接种量

◆继代时间为2周的可用1：10的接种量◆移液管口径可稍大，易吸取细胞

◆接种前后要用酒精灯灼烧瓶口◆定期检查是否有微生物污染

4、生长测定

◆对任何一建立细胞系都应进行生长动态测定

◆不同培养基及不同条件，细胞的最大生长速率可由细胞数、细胞干重或细胞蛋白的对数对培养时间作坐标而测定

◆临界起始浓度：低于此值，细胞无法生长，略高于此值，则延迟期伸长

§常用的生长测定方法

A、细胞计数

血球计数板：

计算公式：细胞数/ml = 5大格内细胞总数×5× 104 ×稀释倍数

B、细胞体积

◆一定量的细胞悬浮液放入15ml刻度的离心管中离心

◆以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示细胞体积

C、细胞的鲜重与干重

◆将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽

滤，然后称重

◆测干重时，将离心收集的细胞转移到预先称重的定量滤纸上，然后80℃烘箱内10 ~ 12h，在干燥器中冷却称重

◆细胞鲜重与干重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示

（三）悬浮培养工艺

1、成批培养

把细胞接种到一个与外界隔绝的只允许气体和挥发性的代谢物质交换的、营养液体积保持不变的密闭系统中培养。

特点

a、培养系统密闭

b、培养基体积固定

c、培养数目、总重量、DNA 含量变化，呈一个“S”曲线

d、使细胞保持对数生长

e、细胞在培养液中分布均匀。

2、连续培养

用一定容积但非密闭的特别容器进行大规模细胞培养的方法。

特点

a、使细胞保持在增殖最快的对数生长期

b、具有稳定的培养状态

c、

适于大规模工业化生产

3、分批培养与连续培养比较

（四）悬浮植物细胞培养反应器

1、类型：机械搅拌式、气动式、混合式

A、机械搅拌式

特点：

◆剪切力大，对细胞易伤害◆消耗功率大

◆易形成供氧不足◆易产生死角

解决途径：

◆建立抗剪切力的细胞株系◆改造反应容器结构

B、气动式搅拌反应器

类型：鼓泡式和气升式

特点：

◆剪切力小◆传质效果好◆运行成本和造价低

◆结构简单◆易保持无菌

三、固相化培养

（一）固相化细胞

把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、纤维膜等上面或里面，细胞不能运动，而营养液可在细胞间流动，供应其营养。

特点：

A、可消除或极大减弱流质引起的切变力

B、细胞缓慢生长，次生代谢物占优势

C、细胞之间紧密接触，利于次生代谢

D、便于操作

E、便于次生代谢物的收集

F、可连续地对细胞作各种化学处理

G、可向反应器中提供大量的、浓度极低的毒性代谢物，从培养基获得代谢物

（二）固相化方法

A、褐藻酸和藻酸盐

褐藻酸：海草灰分离产物，多聚体

藻酸盐：葡糖醛酸和甘露糖醛酸组成的多糖，在Ca++存在下，形成盐胶

B、甲叉藻聚糖

K+存在下，形成强力胶，需先加热熔化

常选用低熔点（5%浓度时，30~35℃）

C、琼脂糖与琼脂

凝固剂、无毒、很好的固相化材料、现在常选用（三）固相化细胞活力检测

A、成活力染色

荧光素二醋酸（FDA）、苯番红染色观察

B、质壁分离

测定质膜完整性；质壁分离剂：甘油、山梨醇

C、呼吸作用

悬浮培养，测定培养时间与耗氧量关系

D、细胞生长

以相对干重表示

E、32P核磁共振

（四）固相化细胞生物反应器

1、特点：