基因工程菌在废水中的应用

基因工程菌在废水中的应用
摘要﹕
随着经济发展，生活水平的提高，环境污染问题日益成为人们关注的焦点，如何治理环境污染也成为我们面前的一个重要问题。

微生物技术在治理环境污染中有着各种各样的优点，随着基因工程技术的发展，人们开始利用基因工程技术对微生物进行改造，从而使其在治理环境污染方面发挥更大的优势。

本文结合我国的实际污染情况，主要介绍了基因工程技术在治理水污染中的应用。

关键词：基因工程微生物废水处理
1 基因工程技术治理废水的概念
利用基因工程技术提高微生物净化污染物的能力是现代生物技术用于废水治理的一项关键技术。

20世纪50年代初，由于分子生物学和生物化学的发展，对生物细胞核中存在的脱氧核糖核酸的结构和功能有了比较清晰的阐述。

20世纪70年代初实现了DNA重组技术，逐步形成了以基因工程为核心内容，包括细胞工程、酶工程、发酵工程的生物技术。

这一技术发展到今天，正形成产业化并列为世界领先专业技术领域之一，广泛应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许多部门，并日益显示出其巨大的潜力，将为世界面临的水污染等问题的解决提供广阔的应用前景[1]。

将基因工程技术应用于重金属废水的治理，就是通过转基因技术，将外源基因转入微生物细胞中表达，使之表现出一些野生菌没有的优良的遗传性状，如对重金属离子高的富集容量以及对特定重金属离子高的选择性，从而实现对重金属离子高效的生物富集。

与传统的生物吸附法不同，生物富集法一般被认为是利用活体菌的某些金属离子转运酶通过某些离子转运通道把金属离子转运到细胞内部的过程。

虽然在活体菌的细胞壁处仍然会存在表面吸附现象，但主动运输过程占主导地位。

对重金属离子的高容量富集或高选择性富集等优良性状与某些微生物对重金属离子的毒性所产生的抗性相关联，由这些微生物在特定的环境中不断进化、变异而获得。

微生物由于存在的多样性以及受所生存的特定环境的影响，其对重金属的抗性也具有多样性，这种多样性主要体现在两个方面，一方面是通过在细胞中产生对金属离子具高结合容量的络合物以络合体内的重金属，以减少
毒性较大的活性游离态重金属离子存在，如真核微生物中大量存在的金属硫蛋白；另一方面则是通过一些特定的金属离子转运系统将胞内的重金属离子转运出去以减少对重金属离子的摄取，大多数原核微生物主要是以这种方式体现对重金属的抗性。

因此，金属络合物和特定金属转运系统是基因工程技术应用于重金属废水治理的两个要素。

2 基因工程技术在废水处理中的应用
基因工程技术应用于废水处理是水处理领域一项具有广泛应用前景的新兴技术。

常规的废水处理方法有物化法、生物法等。

由于一般的物化方法只是污染物的转移，不能从根本上治理，且容易造成二次污染，成本也较高，生物法逐渐成为废水处理的主要方法。

但是由于废水的多样性及其成分的复杂性，自然进化的微生物降解污染物的酶活性往往有限，如果能利用基因工程技术对这些菌株进行遗传改造，提高微生物酶的降解活性，并可大量繁殖，就可以定向获得具有特殊降解性状的高效菌株，方便有效地应用于水污染处理。

因此，构建基因工程菌成为现代废水处理技术的一个重要研究方向，且日益受到人们的重视。

2.1 利用基因工程菌富集废水中的重金属离子
基因工程技术在重金属废水治理中的作用主要体现在提高微生物菌体细胞对重金属离子的富集容量以及提高菌体对特定重金属离子的选择性两个方面。

基因工程菌的构建方式随研究者要达到的目标不同而不同。

2.1.1 提高重组菌对重金属离子的富集容量
若不考虑重组菌对特定重金属离子的选择性而只要提高菌体对重金属离子的富集容量，则通过在微生物细胞表面表达高容量金属结合蛋白或金属结合肽的方法就能很好地达到目的。

从近年的研究进展来看，采用这种方式构建基因工程菌以提高重金属结合容量的报道较多。

Weon Bae[2]等人利用基因工程技术在E.coli细胞壁上直接表达人工合成植物螯合肽2OQly与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白MBP.EC20，结果表明基因工程菌对汞的富集能力达到46mg H+/g.dry cell，比原始宿主茵提高数十倍；K.Kuroda[3]等人在Saccharomycescerevisiae细胞表面表达含His的寡肽，该菌株对Cu2+的抗性得到提高，并且其Cu2+吸附能力与对比菌株相比提高了8倍多。

Patrik等人在Staphylococcus xylosus和Staphylococcuscamosus菌株表面表达含His.Glu.His和His的嵌合蛋白，大幅提高
了对Ni+和Cd2+的结合能力。

Carolina Sousat[5]等人构建表达LamB.MT的E.coli 基因工程菌，使其表达外膜蛋白LamB与酵母金属硫及哺乳动物金属硫蛋白的融合蛋白，对Cd2+的结合能力提高了l5-20倍。

胡章立[4]等人研究了MT.1ike的基因衣藻的重金属抗性和结合能力，研究发现其对镉和铜的抗性和结合能力与野生品系相比有大幅提高，在重金属结合方面，在低浓度(5.101xmol/L)的镉溶液中，转基因衣藻的重金属结合能力是其野生菌株的1.5倍左右，在(30.501xmol/L)的镉溶液中，由于重金属对菌体的毒性，两者差异不大；在处理含铜工业废水时，其处理能力提高10％以上。

值得注意的是几乎在所有的研究中，外源金属结合蛋白或金属结合肽在宿主菌中的表达都是以融合蛋白的形式进行的，这主要是因为大多数金属结合蛋白以及金属结合肽的半衰期很短，如金属硫蛋白的半衰期只有几分钟，而通过与其它蛋白融合的方式表达这些金属结合蛋白或金属结合肽就可大大增加它们的稳定性。

除在微生物细胞表面表达金属结合蛋白或金属结合肽外，将经基因技术在菌体中表达的金属结合蛋白分离后固定在某些惰性载体表面同样也能达到对重金属离子高容量富集的目的。

2.2.2 同时提高重组蕾的富集容量和对特定金属离子的选择
要实现对废水中重金属离子的再资源化，回收过程中生物介质必须对特定重金属离子具有高选择性，这样才可能避免传统生物吸附法因洗脱液中金属离子成分复杂而无法有效再利用其中的重金属资源的问题。

由于高容量金属结合蛋白和金属结合肽本身对金属离子没有选择性，因此重组菌对特定重金属离子的选择性就需要通过在细胞膜处表达特异性金属转运系统来实现，同时还必须使金属结合蛋白或金属结合肽在细胞内部表达以高容量富集由转运系统从胞外转入的重金属离子。

通过特异性金属转运系统的表达，基因工程菌对目标重金属的富集作用就介于特异性蛋白与目标重金属之间才存在的生物亲和力，具有很高的排他性，与生物吸附法的表面吸附特性完全不同，这就使有效回收利用废水中重金属离子，使废水中重金属元素实现再资源化成为可能。

目前已有一些研究者正在从事这方面的研究。

Chen等人通过基因工程技术，在E.coli中同时表达转运系统及谷胱甘肽转移酶与金属硫蛋白的融合蛋白，该基因工程菌的抗汞能力显著提高，汞富集能力达91xmol/g.dry cell，比原始宿主菌提高7倍多，汞去除率达到80％以上，而且金属络合物如EDTA、柠檬酸盐、氰化物的存在对汞的富集没有影响。

此外，该基因工程菌对Hg2+表现出很高的选择性，水体离子强度及pH的变化、共存离子的存在都基本上不影响重组菌的有效富集。

Weon Bae[6]等人以E.coli为宿主菌
同时表达Hg2+转运系统及人工合成植物螯合肽20Gly与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白MBP—EC20，该基因工程菌对汞的富集能力都达到46mg H/g.dry cell，Ni的存在对重组菌的汞生物富集行为没有影响，显示了该重组菌对汞具有很高的亲合性和选择特异性。

在对镍离子生物富集研究方面，Dengt[7]等人利用镍特异性结合蛋白编码基因nixA和金属硫蛋白编码基因转化大肠杆菌宿主菌E.coli JM109以富集水体中的Ni，结果表明基因工程菌对Ni的富集容量比宿主菌提高6倍多，在pH4 10的范围内富集行为基本不受pH变化的影响，最佳pH为7.0左右；钠、钙、镉、铅等离子对Ni2+富集量影响不大，但镁、铜和汞离子的存在将导致重组菌对Ni+的富集量有较大程度的下降。

大多数研究者在考察基因工程菌对重金属离子的生物富集行为时，基本上都是以实验室配制的、组成己知的模拟废水作为考察对象真实废水的组成情况远比模拟废水复杂。

Dengt[8]等人利用汞转运系统和金属硫蛋白构建基因工程菌在一个中空纤维膜反应器中处理某电解厂的真实电解废水，该电解废水直接取自电解厂的废水排放井，未经任何预处理，废水的pH值为9.6，除含有2.58mg/L的Ug外，1550mg/L的钠离子以及铁、锂、锌等十几种共存离子和少量的有机物质。

电解废水经基因工程菌处理后，Ug+降到了5g/C以下，而其它共存离子的浓度基本保持不变，体现出该基因工程菌对电解废水优越的处理效果。

2.2 利用基因工程菌降解废水中的有机污染物
生物处理法是废水中有机污染物降解的主要方法，但是部分难降解有机污染物需要不同降解菌之间的协同代谢或共代谢等复杂机制才能最终得以降解，这无疑降低了污染物的降解效率。

首先，污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程，对细菌来说这是一种不经济的营养方式；其次，某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性，对代谢活性有抑制作用；此外，将不同种属、来源的细菌的降解基因进行重组，把分属于不同菌体中的污染物代谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌，可以有效地提高微生物的降解能力[5]。

Satoshi Soda等[9]将基因工程菌P.putidaBH接种到SBR反应器的活性污泥中，用于处理500mg/L的苯酚废水，在大大提高苯酚去除率的同时改善了污泥沉降性能。

南京大学、扬子石油化工有限责任公司、香港大学、国家环保总局南京环境科学研究所联合完成了跨界融合构建基因工程菌处理石化废水的生物工程技术。

在优化调控技术的基础上，该菌株对二甲苯、苯甲酸、邻苯二甲酸、4-羧基苯甲醛和对苯二甲酸的降解率分别高达86%、94%、99%、97%和94%，比原工艺提
高了20%～30%，总有机碳去除率达到了94%；污水经过处理后，铜、锰、锌、硒的浓度符合国家规定排放标准，生物毒性明显降低。

刘春等[10]以生活污水为共基质，考察了基因工程菌在MBR和活性污泥反应器中对阿特拉津的生物强化处理效果，以及生物强化处理对污泥性状的影响。

结果表明，基因工程菌在MBR中对阿特拉津具有很好的生物强化处理效果，阿特拉津平均出水浓度为0.84 mg/L，平均去除率为95%，最大去除负荷可以达到70mg/(L·d)。

生物强化的MBR对生活污水中COD的平均去除率为71%，COD平均出水浓度65mg/L。

陈俊等[11]采用跨界原生质融合技术，构建基因工程特效菌Fhhh，实现廉价工业化生产Fhhh菌剂，在10m3/d精对苯二甲酸废水处理实验装置中，容积负荷率达到3.0 kg/(L·d)以上，生物负荷率达到1.42d-1，出水水质达到国家一类标准，与国内外同类装置相比，生物负荷率处于先进水平。

吕萍萍等[12]研究发现，克隆有苯降解过程中的关键基因--苯加双氧酶的基因工程菌E.coli.JM109(pKST11)对苯具有较高的降解效率和降解速度，应用于固定化细胞反应器中效果突出。

在较短的水力停留时间内，可以将1500mg/L苯降解70%，降解速度为1.11mg/(L·s)，延长水力停留时间，可以使去除率达到95%以上。

该反应器对高浓度的苯具有突出的处理效果。

同时所得到的产物为环己二烯双醇，可以被野生非高效菌快速利用。

2.3 重金属污染治理的基因工程抗性菌的构建及应用
存在于环境中的重金属可通过食物链在生物体内聚集，并极大地危害人类健康。

传统治理重金属污染的方法有淋滤法、客土法、吸附法、沉淀法、鳌合树脂法和膜技术等物理方法以及络合浸提法等化学方法和生物修复，其中微生物修复具有治理效果好，无二次污染，运行费用低等特点受到人们普遍关注[13]。

微生物之所以能耐受一定浓度重金属的毒性，是因为微生物的多样性及它们生存的特定环境导致了抗性具有多样性，这种多样性主要体现在两个方面: 一是通过在细胞中产生对金属离子具有高结合容量的络合物，以络合体内的重金属降低毒性较大的活性游离态重金属离子存在，如真核微生物中大量存在的金属硫蛋白；二是通过一些特定的金属离子转运系统将胞内的重金属离子转运出去，以减少对重金属离子的摄取，大多数原核微生物主要以这种方式体现对重金属的抗性。

但单纯使用传统微生物法处理重金属在适应性和高效性等方面存在局限性。

针对上述问题，研究者们通过基因工程技术对微生物的金属络合物和特定金属转运系统进行
了改良和改造，构建基因工程菌代替普通微生物处理重金属污染物是近年来研究的热点。

邵群等构建了含有完整的抗砷结构基因及其启动子的重组质粒，通过接合的方法将重组质粒转移到氧化硫硫杆菌中，筛选得到了接合子。

接合子的抗砷水平比对照菌提高了2倍。

但接合转移频率和接合子的抗砷能力，随受体菌的不同而有所差异。

经抗砷性能力检测，与野生菌相比，构建的喜温硫杆菌工程菌抗砷能力明显提高了2倍，且重组质粒在喜温硫杆菌中具有较好的稳定性。

但共存环境中影响工程菌抗砷能力的诸多因素有待进一步研究。

邓旭等[13]将带有汞操纵子和金属硫蛋白编码基因的重组DNA质粒转化到大肠杆菌E.coli JM109中，得到了从废水中富集汞离子能力强的基因工程菌，且工程菌对pH 变化不敏感。

但废水中其他共存离子的存在会导致菌体的平衡富集能力下降30%，从而影响了基因工程菌处理金属离子的效果。

Chen等[14]也将带有汞转运系统和谷胱甘肽与豌豆金属硫蛋白融合基因的重组DNA质粒转化到大肠杆菌E.coli JM109中，使该菌的抗汞能力比原始菌株提高了7倍，还发现金属螯合剂EDTA和柠檬酸对汞的富集影响不明显。

郑杨春等[15]也以大肠杆菌E.coli JM109为宿主菌同时表达汞转运系统和谷胱甘肽与金属硫蛋白融合基因，发现该基因工程菌可以在低Hg2 +浓度环境中仍可有效富集Hg2 +，并且利用连续操作搅拌槽式生物反应器，实现了对有机废水配伍的含汞废水的连续化处理。

虽然金属螯合剂EDTA 对该菌生长抑制作用明显，但基本不影响柠檬酸对其生长富集耦合行为。

Bae等[15]将汞转运系统和植物螯合肽与麦芽糖融合蛋白转化到大肠杆菌E.coli JM109中，使该工程菌对汞的富集能力显著提高，而且Ni2 +的存在对汞的富集无影响。

上述基因工程菌对汞都具有很强的选择特异性和亲和性，但汞离子浓度、离子强度、络合物、共存金属离子等环境因素对其富集Hg2 +的影响却有所不同。

在对Ni2 +生物富集研究方面，邓旭等还通过电穿孔法将含有异性镍转运蛋白基因重组质粒和金属硫蛋白基因重组质粒对大肠杆菌JM109进行转化，得到了同时表达高特异性镍转运蛋白和金属硫蛋白的基因工程菌。

该工程菌不仅对Ni2 + 的富集速率快，而且对镍富集能力提高了6倍。

该工程菌对pH 值、离子强度的变化及其它共存重金属离子的影响都表现出更强的适应性，但Mg2 +、Hg2 +和Cu2 +对富集影响较大。

张迎明等利用PCR 技术从一株金黄色葡萄球菌的基因组中扩增出镍钴转运酶基因，构建重组质粒，并转化到大肠杆菌BL21中，经筛选得到基因工程菌。

该工程菌对镍的富集容量与原始宿主菌相比提高了3倍多，
表达的镍钴转运酶对镍具有较高的特异性。

通过遗传稳定性试验，结果发现重组质粒具有良好的结构稳定性，基因工程菌对镍的富集能力也保持较好的稳定性。

但Pb2 +和Cd2 +的存在对基因工程菌吸附Ni2 +的影响比较大。

此外，Sousa等以大肠杆菌为宿主菌表达酵母金属硫蛋白、哺乳动物金属硫蛋白和外膜蛋白LamB 的融合蛋白，发现该基因工程菌对Cd2 +的富集能力比原始宿主菌提高了15-20倍。

蔡颖等也将两种重组质粒转入大肠杆菌JM109，得到了同时表达高特异性镉结合转运蛋白和豌豆金属硫蛋白的基因工程菌。

该工程菌具有较强的镉离子富集能力，但容易受其他重金属离子的影响。

并且螯合剂EDTA对工程菌富集能力起较强的抑制作用。

两种重组质粒能否长期共存还有待研究。

3 基因工程菌发展趋势与展望
综上所述，在基因工程菌的研究方面，许多学者从不同领域进行了深入研究，并得到了一些有价值的研究成果，但在以下方面，还有待进一步研究，也是今后研究的重点和热点。

首先，彻底搞清基因工程菌遗传的稳定性。

研究发现，基因工程菌在保存及发酵生产过程中表现出不稳定性。

该问题的解决已成为基因工程的成果能否转变为生产力的关键因素之一。

在影响重组质粒稳定性的诸多因素中，宿主细胞的遗传特性、重组质粒的组成和克隆菌所处的环境条件等三方面受到人们的重视，从分子水平讲，影响某些质粒稳定性的基因顺序以及定位；从细胞水平看，只有选择一些具有特定遗传背景的细胞作为宿主方可获得比较稳定的克隆菌。

但还需从广度和深度上进一步研究，以期从根本上提高重组质粒的稳定性。

另一方面，在目前还不完全清楚影响质粒稳定性的原因的情况下，从工程水平上探究决定重组质粒稳定性的各种因素及其对发酵生产的影响十分必要。

其次，是深入研究基因工程菌的安全性。

在治理污染过程中，人们也提出了关于基因工程菌自身所造成的污染。

由此，在一定条件下，是否可以诱导基因工程菌在完成使命后自身死亡，成为了热点问题。

通过基因工程技术，将诱导自杀元件转入基因工程菌的细胞内。

这一元件就是一个可控制的自杀系统，在温度、化学条件等达到要求时，基因工程菌就会失去活性而死亡。

由此，建立相关的监测与评价指标体系，对于指导不同地区的基因工程菌修复实践以及基因工程菌修复技术的发展与完善都具有意义。

此外，利用生物信息技术探究基因工程菌的降解机理。

通过建立环境微生物
的基因库，利用生物信息技术进行基因序列分析、基因定位、克隆新基因、蛋白功能分析及基因表达分析等，加快了人们对微生物降解机理和发育系统生物学等方面研究，其研究成果将成为环境污染综合治理的重要理论基础。

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