动物胚胎体外生产技术

2. 改良 改良Tyrode液（TALP）类 液 ）
1）上浮法 ） 2）Percoll法 ） 法
（二）体外授精
授精通常在覆盖下的微滴中进行，微滴 以50--100微升为宜，一般每滴中加5-10个卵母细胞，精子最终浓度为0.64-1X106个/ML 5%CO2、39度培养，BO液中6-8H，TALP液 中18-24H。
哺乳动物胚胎体外生产技术
一、国内外研究现状
早在100多年前就进行过体外受精尝试； 1951年，精子获能现象的发现，是体外受精的 里程碑； 50—70年代，实验动物上进行了大量研究，并 取得了成功； 80年代以来，由于对胚胎需求量的加大，促进 了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等 相继获得了成功，国内在90年代也在家畜上取得 了成功。 现已将卵母细胞体外成熟—体外受精—早期胚 体外发育，甚至冷冻保存结合在一起，建立工厂 化生产胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的 胚胎。
（二）玻璃化冷冻
冷冻液：EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18% 聚蔗糖+PBSS 冷冻步骤：首先将胚胎放入20%乙二醇溶液 （EFS20）中平衡5min后，用移卵管移入玻 璃化溶液中平衡10min，然后装管，封口。 把细管直接投入液氮冷冻保存。
七、影响体外受精的因素
（一）卵母细胞的成熟度
六、胚胎冷冻保存
（一）常规的慢速冷冻法
冷冻液 1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液 +0.1mg/mlPVP和1.5M乙二醇+0.25蔗糖+P BSS液+0.1mg/mlPVP 冷冻步骤为：①在室温下，先将牛胚胎放入 防冻液中平衡一段时间；②装管；③以每分 钟0.3~0.5℃的速度降温至–35℃；④植冰； ⑤平衡10分钟后，投入液氮中保存。
（二）精子体外获能
（三）公畜的影响
（二）山羊
Hanada等用钙离子载体法获能，受精率达 50%，获得了世界首例试管山羊。刘灵 等 用 肝 素 和 BSA 获 能 ， 受 精 率 最 高 达 89.7%，并获得了世界首例卵泡卵母细胞 体外受精后代。
（三）绵羊
方法与牛相似。
五、早期胚的体外发育
不同的动物早期胚胎体外发育 都存在阻断期， 都存在阻断期，体外发育培养时 需要一些特殊的培养条件如共同 培养细胞，以克服阻断， 培养细胞，以克服阻断，但目前 的发育率仍然比较低，约为40%， 的发育率仍然比较低，约为 ， 是限制体外受精应用的一个突出 问题。 问题。
四、其它哺乳动物精子的体 外获能与体外受精特点
（一）猪
鲜精或冻精用0.9%氯化钠-1mg/ml BSA洗3 次，然后用改良台氏液或TCM-199液稀释 至108个/ml、5%CO2、39度获能孵育60min， 最后在受精液（2-10mM咖啡因、10mg / ml BSA）中授精，精子最终浓度为 105 个 /ml，条件为5%CO2、39度培养4-5h。
2. 成熟培养中添加成分的影响
1)促性腺激素与E2的影响 2)EGF的影响 3)颗粒细胞的影响:低浓度能促进成熟分裂 4)血清的影响
三、牛精子的体外获能与体外受精
（一）精子的洗涤与体外获能
1. BO液类
鲜精或冻精解冻后离心洗涤约2次,每次 5-10分钟,最后的精子小滴悬浮成1-10X 106/ML。 常用咖啡因-肝素-BSA使精子获能。
3. 卵巢内卵泡卵母细胞的获得
数量多，用一组特制刀片对卵巢组织进 行深部切割，采卵率约提高1倍。
只有周围包被着完整卵丘（A级） 或部分卵丘脱落（B级）、胞浆均质 并充满于透明带内的卵母细胞才能进 行成熟与胚胎发育的培养。
（三）卵母细胞的体外成熟培养
1. 成熟培养液与培养条件
最常用的是碳酸氢钠或Hepe’s缓冲的 TCM-199; 5%CO2、饱和湿度、38.5--39度，24H。
二、卵巢卵母细胞的获得与体外成Biblioteka Baidu培养
1. 活体卵巢上采集
母畜超排处理后，利用剖腹术或腹腔 镜技术已能成功地采集卵泡卵母细胞。
2. 屠宰后卵巢上采集
(1)卵巢的采集与保存:宰后立即无菌采集, 30--37度灭菌生理盐水中6H内运回实验室。 (2)卵巢表面卵泡细胞的获得 1)抽取法:18号针头;最常用; 2)剥离法: 3)切开法: