腺病毒的一些常见问题及解答整理自丁香园

汇总了腺病毒的一些常见问题及解答!

1.目前,对于基因治疗的载体选择,很难有一个统一的结论,文章也很多,我将在如下给出。ﻫ本人认为,无论选择哪种载体,关键在于此载体在局部的表达效率。无论就是采用ＩN ＶIVO或者ＥＸVIVO的方法,因为我们最终的目的就是要在局部表达我的目的基因,并且使其具有一定的作用。而对于载体的副作用,目前较为公认的就就是病毒载体转染效率高,但副作用大;质粒载体毒性小,但转染效率比较低。

同时,对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体,pEGFＰ、ｐDsReｄ、pEＹＦＰ与pECFP等:

这些载体如果用于细胞水平的检测,也许会更加的方便、直观,但就是,如果用于体内的基因治疗,那就不就是一个理想的载体了。而传统的表达载体如IＮVITROGEN公司()的pCDNＡ载体系列,会更好一些。

同时,为了获得更加高效的表达,一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体,以增加外源基因的分泌表达。ﻫ

正如一个疾病的治疗一样,治疗的方法越多,就证明还没有一个最有效地治疗手段。基因治疗的载体也就是同样,很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。

以上就是本人的一点愚见,还请各位同道指正。ﻫ

２、转染过小鼠肝癌细胞H２2,请赐教:用什么方法可以达到最佳效果,脂质体、电转还就是重组病毒？如果用脂质体,哪家的最好?

Ｈ２２细胞为悬浮细胞,用病毒(逆转录病毒与腺病毒)最为理想,一就是转染效率高,

二就是不用筛选直接用于实验。但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%,且影响因

素多,而腺病毒感染效率高,几乎可达１00%,但只能短期表达(7-1０天),随着细ﻫ胞传代,外源基因会逐渐丢失。

当然,H2２也可用脂质体进行转染,筛选应在96孔板上进行,由于培养液少、细胞

相对静止,两周后可见细胞克隆生长,在倒置显微镜下用吸管吸取克隆,进行扩大ﻫ培养。

ﻫ3、重组腺病毒作基因治疗,因为不就是很了解,用ＡdEaｓy系统可以不?具体的

实验步骤就是来自什么地方？主要细胞及试剂的来源？

、BIOgenｅ公司有整个系统,从质粒到细胞都有,我AｄEａsy的基本原理请参阅文献

Ｐroc、Naｔl、Acad、Sci、ＵSＡVol、95、pp、２５０9-2５1４,March 1９98ﻫ

4、以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染,查文献,病毒滴度测定用噬斑法,但所用细胞不统一,就是否有统一规定？就用肿瘤细胞来测行不? ﻫ只有能反式提供Ｅ1的细胞才能用来测腺病毒滴度,一般用ＨEK293细胞,用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。

1)腺病毒E1区有转化细胞能力,出于安全性的考虑,也就是为了增加载体的包装容量,现在通行的腺病毒载体就是E1区缺失的。ﻫ２)由于E1区就是复制必需区,所以需要包装细胞系反式提供Ｅ１蛋白,这种细胞系最常见的就就是293系列与９1１细胞。

3)病毒感染性滴度的测定方法有几种。一般就是通过噬斑记数来测定的,所以需要能够支持病变的细胞基质。如果您的病毒带有荧光或颜色标记,可以用一般的细胞系进行滴度测定,前提就是病毒可以感染这种细胞。ﻫﻫ５、腺病毒主要通过ＣAＲ介导感染细胞,感染效率不仅与MOＩ有关,而且与靶细胞表面的ＣＡR 表达量相关,例如对于单核细胞,由于CAR表达量很低,无论MOI有多高,感染率都很低;但对于其她多种细胞类型,腺病毒介导的基因转染效率都很高。而对于脂质体介导的转染来说,脂质体与基因载体的用量都有一定的限制,超量使用对细胞的毒性很明显。我个人认为这两种方法的可比性不强,而且后者在大多数情况下转染效率低于前者。

“腺病毒的转染效率主要取决于靶细胞表面的ＣＡR表达水平与感染时所选定的ＭOＩ“的含义就是什么？ﻫ外壳蛋白未经过改造的腺病毒载体对细胞的有效感染需要细胞膜上表达有两个必要的受体,即负责腺病毒与细胞粘附接触的柯萨奇－腺病毒受体(CＡR)与负责将腺病毒内化的整合素型受体(αⅤβ３、αⅤβ５或αⅢβ１)。ﻫ上述所说应该就是5型Ad(属于A组腺病毒)。对于B组腺病毒如Ad3５,其细胞受体就是CD４6,

在人的所有体细胞表面都有该受体。所以35型腺病毒可以感染几乎所有的人的体细胞。

AGTC公司新近推出的Ａd5Ｆ35载体就是将Ad5的Fibeｒ改造成Ａd35的Ｆibｅr。因此,将会对许多研究者开展干细胞、DC细胞或其它Ａd5难以转导的细胞的基因转移研究有很大帮助。ﻫ

MOI就是病毒浓度的单位。１个MOＩ定义为加入到细胞中的病毒颗粒数,即理论上一个细胞中转入一个病毒颗粒。

ﻫ6、腺病毒的保存方法就是什么?温度应就是-20、7０、80℃？要不要加保护液,例如甘油什么的?做体外实验要不要纯化腺病毒?ﻫ越低保存时间越久。要不要加保护液,例如甘油什么的？可以不要。做体外实验要不要纯化腺病毒？根据需要一般如果在10ｅ1０以上可以不用。

８0℃,10%甘油保存即可。

腺病毒没有那么娇,关键瞧何时要用,4度冰箱可放置1－3月,-20度可保存1-2年,此外,体外的滴度要求不高,无需纯化,但滴度还就是要测的。而体内一定要纯化至高滴度,一般就是在超滤下完成。每次超滤要损失8０%,工作量很大哦。ﻫ

8、用脂质体转染293需7－10天,在这期间要从板分到瓶,可不可以用胰酶消化？

用脂质体转染293细胞就是只需要一天时间,一般就是先将生长状态较好的细胞约50-７0%传入一新瓶,约１2－24小时,用1０0uｌHBS＋10ul脂质体,混合,最好用聚丙已烯管,另外一管用100ulHBS+1０ulＤＮＡ混合,然后两者作用10－１5分钟,用来转染2９3,29３先用无血清DＭEM清洗二次,避免细胞悬浮,加入２ｍl 左右无血清培养基,再缓慢加入上面的混合液,1２小时左右,换含10%血清的DMEM,一般几天后,培养基消耗尽后应换液,也可以从板分到瓶,或就是从小瓶分入大瓶,但绝对不可以用胰酶消化。

ﻫ9、转染后收病毒时,只取2９3细胞弃上清进行冻融还就是连培养上清与细胞一起要呢?

我的实验就是等细胞出现50％左右CPＥ后,一般要传至2-3代才能成功,上清液我通过PCＲ等实验后,发现并没有病毒释放,所以还就是直接10０0ｇ,5mｉn,离心,加入１ｍl左右PBS,分入ｅppendorf,再进行冻融,3-４次后,离心,再转染新的293,

10、转染４8小时后分板时,由于没用酶,简直吹不下来,吹下来的也成团的厉害,怎么处理？

直接种在25CＭ2瓶中,过上7天左右,当中换液,分板的话不能用酶,293细胞应该比较好吹的,如在75CM2中则相对难吹。收病毒的时候都就是细胞有ＣＰE,好多上浮,随便吹就可以。

11、腺病毒质粒(含GFP)转染2９3后有少量荧光出现,再感染扩增后瞧得到2９3有病毒感染的变化,但就是没观察到荧光,就是本身转染失败了,还就是仅GFP丢失呢？会不会有病毒产生却没GFP呢?ﻫ可能就是应用了ＡdEasy腺病毒系统,即就是第一代非增殖腺病毒系统之一。这一类腺病毒通常就是E１缺失伴有E3缺失,它在2９3中增殖需要293中Ｅ１区的功能,同时它可能与２9３中Ｅ1区发生同源重组,从而产生野生型腺病毒。由于野生型腺病毒在２9３的增殖能力通常大于AｄＥａsy腺病毒系统,因此随着病毒传代次数增加,其野生型腺病毒越来越多,需要带有目的基因的AdEasy腺病毒越来越少,就可能出现上述情况。检查就是否出现野生型腺病毒,可用E１内设一对引物,如阳性,即出现野生型腺病毒。亦可以将病毒接MＯI=1感染Hela细胞,如出现病变,即出现野生型腺病毒。

E１缺失的腺病毒在不表达E１的Hela细胞上就是不扩增的,而野生型腺病毒可以扩增,从而产生病毒病变斑。我想选mｏi=1的目的就是避免E1缺失的腺病毒滴度过高,产生细胞病变,影响观察。当然不一定为1,低一点好些。

ﻫ１2、. 已构建目的基因的腺病毒AdEａｓｙ－１用Pac I酶切后,转染２93细胞,２９3细胞的融合度

13、为什么转染后需要孵育7－10天才能行？病毒增殖需要时间ﻫ１4、如就是多少时合适？70-80%ﻫ

果不到７天293细胞就出现了ＣPＥ,怎么办？可以挑克隆坚定

16.如何计算需要扩增病毒的量?产1５、如何测定病毒滴度?哪种方法更好些？TCＩＤ5０法或空斑法ﻫ

量大概就是1E4 ＰFU／ＣＥLLﻫﻫ

17.一个重组腺病毒载体,用293细胞扩增,但加入病毒好几天后,细胞还在长,也没有观察到CＰE的出现,最有可能就是什么原因？ﻫ细胞应为HEＫ293,请确认不就是293Ｔ; ﻫ就是重组病毒还就是重组病毒载体？前者可以直接扩增,后者因系统不同需要共转染或转染HＥK293获得重组