分子标记的种类及其发展

1 引言

1.1 分子标记概念的界定

广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。

1.2 理想的分子标记的界定

理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；

(9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。

但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。

2 分子标记的种类

2.1 限制性片段长度多态性

2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段（通过Southern杂交）、分析结果。由于线粒体和叶绿体DNA较小，前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后

面的几个步骤；对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。

2.1.2 一般选择单拷贝探针。但如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复（Varible number of tandem repeats，缩写VNTR），则产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所引起的多态性。凡是引起重复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技术中有特殊用途（成为分子标记）的重复序列包括：(1) 小卫星(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基10－60个（也有16－100个碱基一说），在基因组中多次出现。(2) 微卫星(microsatellite)或简单重复序列(simple sequence repeats，缩写SSR)：重复单位含有1-5个碱基（也有2-8个碱基一说）(microsatellite一词由Litt & Luty(1989)〔11〕提出)。

2.2以PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记

2.2.1 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，缩写RAPD)：

2.2.1.1基本原理和特点：该技术用一个（有时用两个）随机引物（一般8－10个碱基）非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括：(1)不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息；(2)用一个引物就可扩增出许多片段（一般一个引物可扩增6－12条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物），总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；(3)技术简单，RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术；(4)不象RFLP分析，RAPD分析只需少量DNA样品；(5)成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高；(6)RAPD标记一般是显性遗传（极少数是共显性遗传的），这样对扩增产物的记录就可记为“有/无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子；(8)RAPD 分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结果的〔12〕;(9)由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的带后，并不能保证这些个体拥有同一条（同源）的片段；同时，在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型（一般是琼脂糖凝胶电泳）只能分开不同大小的片段，而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。

2.2.1.2 RAPD技术的发展和相近的分子标记种类：下面提到的所有技术都是利用一个或两个短的富含GC碱基的随机引物：

DAF(DNA amplification fingerprinting)：与RAPD技术不同的是，在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般5－8个碱基），只有两个温度循环（在RAPD中是三个温度循环），并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，DAF通常会产生非常复杂的带型〔5〕。在DAF 技术从基础上，又发展出了ASAP技术(arbitrary signatures from amplification profiles)（使用了不同引物）〔4〕。

AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)：在AP-PCR分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物（如M13通用测序引物）〔20〕。

MAAP(Multiple Arbitrary Amplicon Profiling)：这是Caetano-Anolles (1994)〔3〕创造的一个词，想用来统称所有这些相关技术，但迄今为止这个词很少使用。

2.2.2 特定序列位点

特定序列位点(sequence-tagged site，缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不象RAPD、AFLP 和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性（如难以鉴别片段的来源）。这类分子标记主要包括以下几种分子标记：

2.2.2.1 STMS(Sequence-tagged microsatellites)：通常又称为SSR，也可称为

SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)（生物秀实验频道-生命科学实验中心）

2.2.2.1.1基本原理和特点：引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。其特点包括：一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；得到的结果重复性很高。为了提高分辨力，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，它可检测出单拷贝差异。也可以在同一个反应试管中把PCR反应与不同的STMS引物结合起来（称为multiplexing），这可节省时间，但是，这只能在不同引物的产物在大小上不重叠的情况下