微生物检验技术介绍

5. 尿 素 酶 试 验
（三）碳源和氮源利用试验
1. 柠 檬 酸 盐 利 用 试 验
（四）酶试验
1. 凝 固 酶 试 验
2. 硝 酸 盐 还 原 试 验
3. 溶 血 试 验
（五）抑菌试验
氰 化 钾 试 验
（六）血清学试验
凝集反应
4.抗原抗体反应的种类
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1.常用器具的灭菌 常用器具：试管、烧瓶、培养皿、涂棒、
移液管、接种环等
二.
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无菌技术
方法：这些器具在灭菌前须先进行包扎或
装入特定容器中。 （1）高压蒸汽灭菌 15~30min （2）高温干热灭菌 （3）烧灼灭菌 0.1MPa 121.3℃ 160~170℃ 2h
2.培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌 过滤灭菌：适于不耐温的材料 3.操作台、无菌室（无菌箱） 紫外杀菌 、臭氧消毒、消毒剂 等
（一）培养基的类型
1.按物理状态来分
液体培养基：不含凝固剂，利于菌体的快速繁殖、代谢和 积累产物
流体培养基：含0.05～0.07%琼脂粉，有利于一般厌氧菌 的生长繁殖 半固体培养基：含0.2～0.8%琼脂粉，多用于细菌的运动 能力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料等
固体培养基：含1.5～2.0%琼脂，多用于细菌的分离、鉴 定、菌种保存及细菌疫苗制备等方面
3.稀释摇管法：适于分离严格厌养菌。
一系列盛由固体培养基的 试管→加热熔化→冷却至 50℃左右加入待分离材料 进行梯度稀释→迅速摇匀 →冷凝→倾注一层灭菌过 的石蜡→培养→挑取单个 菌落.
（二）平板划线分离法
（三）单细胞（单孢子）挑取法 适用于分离混杂微生物中弱势群体 方法： （1）用显微操作仪在显微镜下用毛细吸管或显微针、钩 、环等挑取→获得纯培养 （2）用一般显微镜，将一滴经适当稀释后的菌液置于载 玻片上，选取只含有一个细胞的液滴进行纯培养的分离 此法多限于高度专业化的科学研究中采用
2.按成分来分
１）天然培养基：指利用各种动、植物或微生物的原料，其 成分难以确切知道。例如：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵 母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等 ２）合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基， 是用已知化学成分的化学药品配制而成 ３）半合成培养基(综合培养基）：在合成培养基中，加入某 种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几 种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗 糖培养基等
无菌技术的用具和设备 接种环和接种针 酒精灯 超净台/生物安全柜 无菌室
无菌操作在火焰旁或无菌箱、超净工作台上操作。
无菌操作 倒平板
三、纯培养技术
纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在的状态 中分离、纯化出来的技术
纯培养（pure culture）：微生物学中将在实验
室条件下，从一个细胞或一种细胞 群繁殖得到的后代 ，称为纯培养
（二）培养基中的成分
1.水：自来水、蒸馏水 2.琼脂：透明、无味，化学结构稳定，不易被微生物分解利 用，在培养基中仅起凝固剂的作用
3.氮源
（1）有机氮源
（2）无机氮源
硫酸铵 尿素 碳酸氢铵 硝酸铵 氮气 等
4.碳源类
5. 稀释溶液 磷酸盐缓冲液、生理盐水 、缓冲蛋白胨等
6. 无机盐 锌、钴、锰、铁、钙、铜、镁、硫、磷、钾、钠
3.按功能来分
选择性培养基——含有目标菌生长需要的特殊营养物质,抑 制非目标菌生长的抑制剂 选择性增菌培养基——液体
选择性分离培养基——固体
鉴别培养基——通过指示剂或指示剂和抑菌剂的共同作用 来鉴别不同类型的微生物
4.按制备方法分类
自行配制——成本相对较低，但繁琐，质量不稳定。 即用型培养基——使用方便，但保质期短。 干粉培养基——使用方便，质量稳定，易保存，推广空间 广阔。
微生物检验技术
XLD 琼脂 （Xylose Lysine Desoxycholate Agar）
Contents 1 一、培养基的制备技术
2 3 二、无菌技术 三、纯培养技术 四、显微技术 五、生化鉴定
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一、培养基的制备技术
培养基
人工配制的，适合微生物生长、 繁殖或产生代谢产物的营养基质
四、显微技术
（一）显微镜构造
使用方法
①低倍镜的使用②高倍镜的观察③油镜的观察 注意事项
①取放时动作一定要轻 ②观察带有液体的临时标本时要加盖片 ③粗、细调节钮要配合使用 ④观察时要从低倍镜开始，看清标本后再转用高倍镜、油镜。 ⑤使用油镜时一定要在盖玻片上滴油后才能使用。 ⑥不可用手摸光学玻璃部分 ⑦使用的盖玻片和载玻片不能过厚或过薄。 ⑧凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品 ⑨实验完毕，放回镜箱。切不可把显微镜放在直射光线下曝晒。
（四）利用选择培养基分离法
1.抑制其它微生物的生长
控制pH、温度，加抗生素等
2.富集培养
光照、温度、高压、紫外线、氧气、营养等 通过设置有利于某些或某一微生物生长的特定条 件，使适应该条件的微生物旺盛生长 此法易分离到某些特定微生物或弱势微生物
斜面接种
接种技术
液体接种
穿刺接种
革兰氏染色的机制
程序：（1）初染（结晶紫，30S） （2）媒染剂（碘液，30S） （3）脱色（95%乙醇，10～20S） （4）复染（蕃红，30 ～ 60S） 结果判断： 菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+） 菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-）
大肠杆菌（G-）
金黄色葡萄球菌（G+）
沙门氏菌（G-）
油镜的工作原理 加油原因： 1.增加视野亮度 2.增加分辨率： 最小可分辨距离=λ / 2NA NA= n .Sin α
暗视野显微镜
相差显微镜
荧光显微镜
（二）染色技术
1.简单染色
制片——固定——吕氏碱性美蓝染液(或石碳酸复红染液)染 色1-2分钟——水洗——干燥——镜检
2. 革 兰 氏 染 色
菌落形态观察 菌落形态一般在培养24～48 h内肉眼观测 ，不同培养基菌落形态可发生变化。菌落 的特征一般根据下列各项的观察来表示
包括菌落大小、形状、高度、边缘、颜色 、表面状态、密度、硬度等
液体培养基中生长状况观察
细菌个体基本形态和特殊结构观察
个体基本形态 球菌、杆菌、螺旋菌 特殊结构观察 荚膜、芽孢、鞭毛
枯草芽孢杆菌（G+）
粪肠球菌（G+）
五、微生物的生化鉴定
（一）糖苷醇类代谢试验
1. 糖 发 酵 试 验
2. O N P G 试 验
3.MR,V-P试验
4.七叶苷水解试验
（二）氨基酸和蛋白质代谢
1. 靛 基 质 试 验
2. 氨 基 酸 脱 羧 酶 试 验
3. 硫 化 氢 试 验
4. 苯 丙 氨 酸 试 验
混合培养物：含有两种以上微生物的培养物 二元培养物：只含有二种微生物，并保持二者之
间特定关系的培养物
无菌操作（一）稀释法
1.稀释平板法
2.液体稀释法：适于细胞较大的微生物
待分离材料→接种于培养液中→培养→ 测定或估计单位容积中的含菌数目→稀至 两、三滴液体中只含有一个微生物个体→ 每次取一滴至另一盛有新鲜培养基的试管 中→摇匀，培养→观察→大多数试管无微 生物生长，少数管底有一菌落，可能由一 个细胞繁殖而来。
其他鉴别成分 卵磷脂（或卵黄）、磷酸酯、甘油三丁酯、吐温 等酶类水解试验。
（三）培养基的制备和使用
1. 称量和复水 2. 溶解 3.pH值调节 4.分装 5 灭菌和贮藏 煮沸 湿热灭菌或过滤除菌 内备用 6.使用 琼脂培养基的融化 添加成分的加入 培养 弃置
添加成分
4℃冰箱
二、无菌技术
几个常见的概念：灭菌、消毒、防腐 无菌技术
7. 生长素 氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等
8 有鉴别指示作用的成分
pH指示剂 观察各种细菌对糖、醇和苷类等碳水化合物的发酵 反应
糖、醇、苷类 用以鉴别细菌的发酵。
有机酸盐类 pH值下降，使指示剂的颜色改变；铅盐沉淀 氨基酸和蛋白质 靛基质、霍乱红和硫化氢反应；蛋白胨、氨 基酸、尿素以及明胶等酶解试验