细胞工程

第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术

植物细胞培养基的组成成分

1.无机化合物

大量元素(major element) ：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S

微量元素(minor element) ：Fe、B、Zn、Cu、Mn、Co、Mo

2.有机化合物

（1）维生素：直接参与酶的形成以及蛋白质、脂肪的代谢，常用的有维生素VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB3（烟酸）、VB9(叶酸)、肌醇以及维生素•C(抗坏血酸)等（2）氨基酸：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等

（3）其他有机附加物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、麦芽浸出物（ME）、酵母浸出物（YE）等

3.碳源和能源

常用蔗糖，作为碳源和能源，同时也可维持一定的渗透压；也可用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。

4.植物生长调节物质(Plant growth regulator)

（1）生长素类(auxin)：促进细胞生长和分裂，用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，常用的有2,4-D、IAA、NAA和IBA等

（2）细胞分裂素类(cytokinin)：促进细胞分裂；诱导愈伤组织或器官的分化，常用6-BA、KT、ZT等

（3）赤霉素类:常用赤霉酸(GA3)，可促进幼苗茎的伸长生长和胚状体发育成小植株

（4）脱落酸

（5）乙烯

5.固化剂

常用琼脂，一般用量为0.6～1.0％，有时可配成不加固化剂的液体培养基，进行液体浅层培养，液体培养有如下优点：低成本、生长快、移栽成活率高等。

6.其他成分：

活性炭、硝酸银、抗生素等

动物细胞培养基的组成、常用培养基类型、常用溶液

培养基的成分

1.糖类：作为碳源和能源，主要是葡萄糖，含量一般为1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）

2.氨基酸：12种必需氨基酸

3.维生素：包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等

4.无机盐类：大量元素包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO43-等，微量元素包括Cu2+ ，Zn2+ 和Mn2+等。

5.生长类因子及激素：血清中含有生长因子、促进细胞贴壁的因子、矿物质、激素、脂类等，另外血清可以抑制胰酶的活性。

常用培养基

1.天然培养基：直接取自动物组织提取液或体液作为培养基，如血清、淋巴液、血浆凝块、水解乳蛋白、胶原等，成分复杂，来源有限

2.合成培养基：常用的有BME、MEM、DMEM、IMEM、199、F10、F12、PRMI-1640等，人工设计、化学成分明确，但缺乏各种激素和生长因子，往往需加入5%-10%小牛血清

3.无血清培养基：组成成分已知，一般由基础培养基、激素和生长因子、基质三部分组成

其他常用溶液

平衡盐溶液(BSS)：主要由无机盐和葡萄糖配制而成，用于维持细胞的渗透压、维持pH

值和细胞正常的代谢等；最常用的有PBS、Earl液和Hank’s液。

PH调节液：NaHCO3溶液和HEPES缓冲液

消化液：常用的有胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液

抗生素溶液：双抗溶液（链霉素、青霉素）

第十二章动物细胞培养技术

概念：动物细胞培养:是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

培养细胞生命期:

原代培养:也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。

特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。

传代培养:当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代或传代培养。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。

特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。

细胞系:原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力、类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。

细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得到的单一类型的细胞群体。

器官培养:是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外培养，保持其原有器官细胞的结构和联系。

体外培养细胞的形态分类

贴附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。

粘附型细胞的生长类型及其特点

1.成纤维细胞型

生长特点：排列成放射状、漩涡状，并不紧靠连成片，细胞与细胞间接触易断开而单独行动。

2.上皮细胞型

生长特点：易相连成片，生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。

3.游走细胞型

生长特点：在支持物上散在生长，一般不连接成片，细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动。

4.多形细胞型

生长特点：有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，生长时呈多角形生长，并伸出较长的神经纤维，难以确定他们的规律和稳定的形态，可通归入多形细胞型。

消化细胞常用的酶类

胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶菌酶、木瓜酶等动物细胞体外培养的一般过程

1.取材

2.原代培养

3.传代培养

4.细胞的冻存复苏

原代培养的方法

1.组织块培养法

（1）薄层培养法

（2）翻转干涸法

2.分散细胞培养法

（1）机械分散法

（2）消化分散法

动物细胞大规模培养的方法

1.转瓶培养：培养过程中转瓶不断旋转，是细胞交替接触培养液和空气。

2.反应器贴壁培养：细胞贴附于反应器内固定的表面生长。

特点：比较容易更换培养液，不需要特殊的分离和培养设备，但难以扩大规模。

3.悬浮培养

主要用于非贴壁依赖型细胞的培养。

特点：成本较低，可连续收集部分细胞进行传代培养，传代时无需消化分散。

4.固定化培养

将细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养。

大规模培养的工艺类型

1.分批式培养：细胞和培养液一次性加入和取出

2.流加式培养：培养过程中连续或半连续流加浓缩培养液，培养结束后取出反应体系。

3.半连续式培养：也称反复分批式培养，培养过程中多次取出部分培养物，再补充等量新的培养液。

4.连续式培养：培养过程中连续排出培养物，同时连续加入新鲜的培养液

5.灌流式培养：培养过程中不断排出部分旧培养液，同时不断灌注新的培养液。

固定化培养的方法

（1）微载体培养法

以葡聚糖或其他聚合物制成直径从几十微米到几百微米的固体小珠——微载体。将细胞吸附在其表面，共同悬浮于培养容器中培养。每毫升培养基可达到1000万个细胞的密度。

（2）多孔微载体培养法

其内部具有网状结构的小孔，能最大限度地扩大比表面积，细胞在孔内生长，可免受机械损伤。

（3）中空纤维培养法

由丙烯聚合物制成中空纤维，能高度透过小分子营养物质，细胞能在其外壁上附着生长。通常一个培养筒内由数千根中空纤维组成，然后封存在特制的圆筒内，组成培养系统。该系统主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。

（4）微囊培养法

将细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，逐滴滴入氯化钙溶液中，形成小球，再先后用聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺溶液处理，表面形成一层半透膜，制成微囊。其代谢过程中的废物可通过半透膜不断排出，但分泌的活性蛋白则积累在半透膜形成的囊内。

器官培养的方法

1.表玻璃器官培养法

2.琼脂凝胶培养法

3.擦镜纸培养法

4.金属格栅器官培养法