实验三、 大肠杆菌半乳糖苷酶诱导表达

4. β-半乳糖苷酶力单位和比活力
本实验把在pH 7.0 的缓冲液中，30℃保温酶解，每 分钟释放出 1μmol ONP的酶量，定义为一个酶活力 单位。
OD420 酶活力单位 (U/ml)= 反应时间(min)×酶液体积(0.5 ml)×1.1
式中：1.1 是ONP的微摩尔消光系数
酶比活力=
每毫升菌液酶活力单位 (U/ml) OD600
实验结果
将结果记录下表，并以取样时间为横坐标， β-半乳糖苷酶比 活力为纵坐标绘图。为便于比较，将5组曲线图绘制在同一坐 标纸上，并对结果进行分析和讨论。
表 大肠杆菌中β-半乳糖苷酶的诱导合成及调控实验结果
取样时间 组别 (min)
菌液浓度 (OD600)
产物浓度 (OD420)
酶活力单位 (U/ml)
♣ IPTG，不被分解，比乳糖提高~3倍；
♣ 葡萄糖效应：葡萄糖和IPTG，被显著阻遏；
♣ 葡萄糖+IPTG+cAMP，不受葡萄糖影响。
实验原理
邻硝基苯酚-β-D-吡喃型 Β-半乳糖苷酶 半乳糖苷 ONPG 邻硝基苯酚 ONP +乳糖
420nm下吸光度
实验材料
1. 菌株
大肠杆菌 (E. coli K12)
第一组：乳糖对β-半乳糖苷酶的诱导
(1). 往25 ml 基本培养基的三角瓶中加 1 ml 10%的甘油； (2). 接种25 ml 生长在甘油培养基18h的菌液，计时，
并取1ml测OD600；
(3). 30℃ 水浴摇床振荡培养1 h，取 1 ml并测OD600值。 然后向培养基瓶中加 1ml 10%的乳糖，摇匀并开始 计时。立即取出500μl培养液到含有SDS和氯仿的小 离心管中，至于冰浴中，此管为0min样品。培养瓶 继续在30℃水浴摇床振荡培养；
现代微生物学实验技术
马玉超
北京林业大学生物科学与技术学院
办公地点：生物楼117；电话：62336016； Email:myc0307@gmail.com
实 验 内 容
♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列
♣ 转座子随机突变及目的表型的筛选
♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
(4).每5min取500μl培养液用于测定β-半乳糖苷酶活 性，共取10次，然后每10min取样一次，共10次。 (5). 每20min 取 1ml 样品测OD600值
注意：取样离心管要编号，并记录取样时间。
第二组：无诱导剂时β-半乳糖苷酶的
(3). 不加任何物质
第三组：IPTG对β-半乳糖苷酶的诱导作用
分5组实验，准备5份种子液。
注：平板不要大家准备 周四晚上7点来接种—5 ml 试管 周五下午两点来接种—25 ml 三角瓶
2. 酶的诱导合成及其调控
分组进行，实验结束后全班集中整理出总的实验结果 每组： A. 25 ml 基本培养基的三角瓶 B. 21个2 ml 离心管，加入20μl 0.1% SDS和 40 μl 氯仿，盖严后至于冰浴； C. 10个2ml 离心管，测OD600.
实验原理
调节基因 控制单元
i p o z
结构基因
y a百度文库
CAP结合位点 cAMP-CAP复合物
操纵基因 调节基因 ß -半乳糖苷酶
结构基因
透性酶 乙酰基转 移酶
启动子 操纵子
正调控模型
实验原理
大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一类诱导酶
♣ 无作用底物(乳糖或半乳糖苷)时，几个分子/细胞；
♣ 中性培养基中加入乳糖(诱导物)， 103~105倍；
酶比活力 U/ml OD600
1 2 3 4 5
●下次实验
♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性
♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达
张妙直
实验目的
1. 加深对大肠杆菌乳糖操纵子的理解； 2. 证实β-半乳糖苷酶是诱导表达的，且该酶的合成受 到严格调控。
实验原理
调节基因 控制单元 i p o z 结构基因 y
乳糖操纵子
a
操纵基因
调节基因
启动子
ß -半乳糖苷酶
结构基因
透性酶
乙酰基转 移酶
负调控模型 诱导物：乳糖或IPTG
(3). 30 μl IPTG (200 mg/ml)
第四组：葡萄糖对乳糖诱导作用的影响
(1). 1ml 10% 葡萄糖； (3). 1ml 10% 乳糖
第五组：葡萄糖对IPTG诱导作用的影响
(1). 1ml 10% 葡萄糖； (3). 30 μl IPTG (200 mg/ml)
3. β-半乳糖苷酶活性的测定
(4). 其他试剂
10% 甘油，10%乳糖，10%葡萄糖，IPTG (200mg/ml), ONPG (4mg/ml), 1 mol/L Na2CO3 0.1% SDS, 氯仿
3. 主要仪器
可见光分光光度计，摇床
实验步骤
大肠杆菌中β-半乳糖苷酶的诱导合成
1. 菌悬液制备
将E.coli K12接种到固体2×YT平板上进行活化，挑取 单菌落接种至5 ml 2×YT 液体培养基中，37℃培养过夜， 2%的接种量接种至 25 ml甘油培养基中， 37℃培养 18 h， 作为下面实验接种用的种子液。
2. 培养基及试剂
(1). 基本培养基(M9培养基) KH2PO4 30g； Na2HPO4 60g；NaCl 5g； NH4Cl 10g。 溶解后加水至1L，121℃灭菌20min。 灭菌后，在100 ml M9中加入： 0.1 mol/L MgSO4 10ml, 0.01 mol/L CaCl2 10 ml, 加无菌水至1L，作为基本培养基。
(2). 2×YT培养基
蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g，加去离子水至1L。
(3). Z缓冲液
每升含有一下成分： Na2HPO4· 2O 12H (0.06 mol/L) NaH2PO4· 2O 2H (0.04 mol/L) KCl (0.04 mol/L) (0.01 mol/L) MgSO4· 2O 7H (0.001 mol/L) 巯基乙醇 (0.05 mol/L) pH 7.0 21.5g 6.2g 0.75g 0.246g 2.7 ml
(1). 将上述含样品的小离心管从冰浴中取出，置于 30℃水浴中平衡10 min；
(2).在每个小离心管中分别加入500μl Z缓冲液和 200μl底物ONPG(4mg/ml)，反应一直到黄颜色 出现，加入500 μl 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应 （计时）
(3). 离心后取上清测OD420，值在0.2-0.8范围内，测 定的结果较为可靠。