尿酸酶活力测定实验方法

1.1实验方法
1.2.1蛋白质含量测定
蛋白含量测定采用考马斯亮蓝检测法(Bradford检测法)和A280光吸收法，具体操作按文献[13]进行。

1.2.2尿酸酶活性测定方法
1.2.2.1主要试剂[14]
a)硼酸缓冲液储备液(20 mmol/L EDTA，0.02% Triton-X100，pH8.5 1 mol/L
硼酸缓冲液)
称取硼酸6.185 g，硼砂9.535 g，EDTA 1.169 g，10％Triton X-100 400 μL，ddH2O定容到200 mL。

b)尿酸稀释液(1 mmol/L EDTA，0.001% Triton X-100，pH8.5 50 mmol/L硼
酸缓冲液)
取硼酸缓冲液储备液8 mL加入ddH2O 152 mL，检测pH=8.5。

c)尿酸酶工作溶液储备液(0.01% 尿酸，1 mmol/L EDTA，0.001% Triton
X-100，pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液，用棕色瓶冷冻保存)
准确称取10 mg尿酸溶解于稀释液中，并准确定容至100 mL，此溶液作为储备液保准于4℃，测定活性时用相同缓冲液稀释10倍使用。

d)尿酸酶酶活测定工作液(0.001%尿酸，1 mmol/L EDTA，0.001% Triton
X-100，pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液，用棕色瓶冷冻保存)
将尿酸酶工作溶液储备液稀释10倍即得。

1.2.2.2酶活性测定过程[14]
先加入2 mL尿酸溶液和0.5 mL ddH2O于试管中，于40℃水浴中保温5 min。

加入0.5 mL适当稀释的酶液到试管中，准确反应5 min后，加入0.2 mL 20% KOH 终止反应。

根据尿酸于290 nm处的特征吸收，测定尿酸被尿酸酶氧化生成尿囊素后，剩余尿酸在290 nm处吸光值。

空白管则先加入KOH，再加入酶液，立即混匀，读取290 nm处吸光值。

1.2.2.3酶活力单位的定义[14]
在40℃、pH8.5下，每分钟催化1 μmol 尿酸分解所需要的酶量定义为1个酶活力单位。

酶活力(U/mg)=(U/mL)×1/C
Vt ：总体积(3.2 mL)，Vs ：样品体积(0.5 mL)，t ：反应时间(5 min)，12.04：测试条件下的尿酸摩尔消光系数， 1.0：比色皿光径(cm)，df ：稀释倍数，C ：酶浓度(mg/mL)。

1.2.2.4 尿酸浓度标准曲线
将尿酸酶工作液储备液用pH8.5 50 mmol/L 硼酸缓冲液稀释至尿酸浓度为0.06 mmol/L ，按表1.2加入0.06 mmol/L 尿酸溶液、pH8.5 50 mmol/L 硼酸缓冲液，每组测定样分别作3个平行测试对照。

表1.1：测定尿酸浓度标准曲线方法 Table 1.1: Standard curve of uric acid
编
号 0.06 mmol/L 尿酸
(μL )
pH8.5 50 mmol/L 硼酸缓冲液
(μL)
尿酸终浓度(mmol/L) 0 0 200 0 1 40 160 0.012 2 60 140 0.018 3 80 120 0.024 4 100 100 0.030 5 120 80 0.036 6 140 60 0.042 7 160 40 0.048 8 180 20 0.054 9
200
0.060
各管摇匀后静置约1 min ，以不加尿酸的空白管(管号0)调零，用分光光度计测定290 nm 处的光吸收值。

以尿酸浓度对290 nm 处的光吸收值作图，得到尿酸浓度标准曲线(图1.1)。

酶活力(U/mL)=
(OD blank －OD test ) ×Vt×df
12.04×1.0×Vs×t
Fig 1.1 Standard curve of uric acid。