水稻遗传转化体系Protocol样本

水稻遗传转化体系Protocol

Introduction

1．水稻的遗传转化研究历史与现状

20 世纪80 年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3

个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用”电击法”

或”PEG 介导法”等方法将外源基因导入到水稻中并获得再生植

株[1~3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中获得成功[4], 随

后成为水稻遗传转化的常见方法之一。1993 年, Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化

体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常见的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅

缩短[7]。虽然Hiei 等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻

的转化不再困难, 可是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转

化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据她们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼稻的转化能够在两

个半月内完成, 且转化效率非常高(一个幼胚能够得到5~13 个独

立的转化植株)。

2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]

a. 转基因抗虫水稻

对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 当前,最有希望和

前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造

出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 可是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品

种往往推广数年后就会失去抗性。

b. 转基因抗病水稻

见抗水稻病毒研究

c. 转基因抗旱水稻

d. 转基因营养高效利用水稻

e. 转基因优质水稻

f. 转基因高产水稻

g. 转基因抗除草剂水稻

3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用

随着RNA干扰技术( 包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰) 在抗病毒基因工程上的广泛研究和应用[13~18 ], 结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术来研究水稻, 获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视, 成为国内外水稻病毒研究的热点。当前, 国内在这方面属于起步阶段, 仅仅做了一些构建干扰载体和获得RNA干扰植株[19~27], 但并没有获得高抗植株, 国外, 特别是日本在这方面有着较大优势, Omura T实验室分别在和已获得了对

RDV、 RSV高抗植株[28, 29], 另外Himani在也获得了对RTBV 高抗的植株[30]。( 重要是看以上文献, 一定要认真体会)

Materials and methods

一、接种

步骤:

1、保存在-20度的种子使用前取出( 用多少取多少, 用纸包好) ,

置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右( 最好过夜) 。

2、拨去种皮( 1) , 尽量不要损害到种胚, 拨皮后检查, 将胚乳表

面发黑或胚死亡的种子剔掉( 2) , 用纸包好带入组培操作间。

3、( 以下操作均在超净工作台内进行) 将种子倒入干净的100ml

三角瓶中, 加入75%乙醇消毒2分钟, 期间要不断的摇动, 倒出酒精, 再加入20ml 2%的NaClO(3),覆盖种子即可, 室温在摇床上160rpm摇25min, 将NaClO倒掉, 将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上, 在超净工作台上吹干为止, 然后将种子接入诱导培养基( NB培养基) ( 5) 上, 每皿20粒( 4) , 注明日期, 封口膜封口, 置于27℃恒温箱中暗培养( 15) ;

二、掐芽

种子在培养箱中培养7天后, 长出可见的芽和遁片, 根据种子的生长状态, 将芽掐掉( 16) , 继续在27°C恒温箱中暗培养。三、继代

掐芽后7天左右, 进行第一次继代, 用镊子将新长出的愈伤

夹成小块( 17) , 转入新的NB培养基中, 每皿20粒, 在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代, 培养15天后, 就能够长出颜色鲜黄, 表面光滑, 直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤能够进行预培养, 小的就进行第三次继代。

四、农杆菌介导的水稻遗传转化

共培养( 整个操作过程需8天)

第一天: 选取自然分散, 颜色鲜黄, 直径约为2-3mm的颗粒愈伤, 置于27度暗培养4天。

第三天: 农杆菌划线28°培养, 两天后农杆菌长满即可洗脱( 18) , 用于转化。

第五天: 悬浮农杆菌, 悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮( AS) (19)20ML的AMM液体培养基(20)中, 剧烈震荡1min后, 静置1h, 让农杆菌形成悬浮液, 取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤, 略微摇动静置30min, 于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基( AS培养基( 21) 上27度暗培养3天。

第八天: 等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑, 但未长满愈伤时, 挑取愈伤于无菌培养瓶中, 用无菌水冲洗, 直至无可见菌丝为止, 最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h, 置于无均滤纸上晾干后, 转移至筛选培养基上。

五、抗性愈伤的继代筛选

当抗性愈伤在朝霉素30培养基( 22) 上生长15天后( 23) , 将愈伤换到新的朝霉素30培养基上, 15天后可观察到一些褐化愈

伤开始长出的新的愈伤, 继续培养, 等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基( 24) 上, 筛选3-7天。

六、分化

从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基( 25) 上再生, 成团而不是分散放置( 26) , 一周后愈伤开始转绿, 三周后开始长出幼芽, 随后根也长出, 当芽长至2-3cm时, 就可移至1/2MS培养基( 生根培养基) 上( 27) 。

分化间进行, 25°( 28) , 光14小时, 暗10小时。

七、生根

超净工作台内进行, 每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗( 29) , 在生根培养基上生长10天。( 30) 分化间进行, 25°, 光14小时, 暗10小时。

八、炼苗

生根十天后开盖, 加已晾两天或晒过的水, 泡过培养基即可( 28) , 2天后( 28) 用水洗掉生根培养基, 加晾两天或晒过的水浸过根, 3-7天后待生长状态好了后移栽大田。( 期间每天要加水, 确保根都泡在水中) 。分化间进行, 25°, 光14小时, 暗10小时。

九、移栽大田

土、水提前晒上两天, 移栽盆装4/5体积的土, 用水浸透即可, 不能太多水, 刚好浸过土面最好。

移栽: 在盆上标记好, 盆宽移栽两株, 长四株; 移栽时不能插深, 植株能站住即可。