虾青素体外清除自由基活性的研究

添加剂与调味品
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010 年 第 35 卷 第 4 期
虾青素体外清除自由基活性的 研究
尹 蔷 1， 尚小玉 2*， 张泽生 1， 孙利娜 2 (1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；
2.天狮集团有限公司，天津 301700)
虾 青 素 ( Astaxanthin ) ， 是 海 洋 生 物 体 内 主 要 的类胡萝卜素之一，化学名称为 3,3′-二羟基-4,4′二 酮 基 - β , β ′ - 胡 萝 卜 素 ( 3 , 3 ′ - dihydroxy - β , β ′ carotene-4,4′-dione)，分子式为 C40H52O4，相对分 子量为 596.86[1-2]，化学分子结构式如图 1 所示。
图 2 虾青素和 Vc 对·OH 的清除效果
由图 2 可知，虾青素和 Vc 对·OH 均有清除作 用，且清除的效果与添加的剂量正相关。在低浓 度时，虾青素就表现出比 Vc 要强的清除作用，随 着浓度的增加，虾青素对·OH 的清除效果明显提 高，且比 Vc 显著。当向反应体系中添加 1 mL 浓 度为 40 μg/mL 的虾青素时，·OH 的清除率达到了 75.6%，Vc 清除率只有 42.5%，同浓度的虾青素比 Vc 的清除率高 33.1%。当浓度为 100 μg/mL 时，2 种 抗 氧 化 剂 对·OH 的 清 除 率 分 别 为 85.5% 和 72.0%，虾青素比 Vc 要高 13.5%。由此可见，虾 青素对·OH 的清除效果要显著强于 Vc。 2.3 虾青素和 Vc 清除 O2-·能力的比较
将虾青素用乙醇、Vc 用水配 成 5、10、20、 40、60、80、100 μg/mL 等浓度的溶液备用， 另 配制浓度为 2.5×10-4 mol/L 的 DPPH 乙醇溶液，避
光保存。具塞试管中加 2.7 mL 2.5×10-4 mol/L 的 DPPH 无水乙醇溶液，再加入 0.3 mL 抗氧化剂的 溶液，混匀，在室温下 30 min 后于 517 nm(最大吸 收波长处)下测定吸光度。样品对 DPPH 的清除率 K 可用下式计算：
浓度为 90 μg/mL 时，清除率为 95.0%。结论：虾青素具有明显的抗氧化活性。
关键词：虾青素；VC；自由基；抗氧化
中图分类号： TS 202.31005-9989(2010)04-0232-03
Study on free radical scavenging property of astaxanthin
摘要： 目的：通过与 VC 的对比实验，研究虾青素的抗氧化能力。方法：分别采用 DPPH 自由基
测定法、水杨酸法以及邻苯三酚自氧化法，研究虾青素和 VC 在清除 DPPH 自由基(DPPH·)、羟基 自由基(·OH)和超氧阴离子(O2-·)的能力。结果：虾青素能有效地抑制羟基自由基、超氧阴离子自由
基，且清除率大于 VC，清除 DPPH·自由基方面虽然略低于 VC，但同样表现出较高的清除率，当
取 0.05 mol/L pH8.2 的 Tris-HCl 缓冲液 4.5 mL 于试管中，置 25 ℃水浴中预热 20 min，加入 1 mL 供试液、2.5 mmol/L 邻苯三酚 0.5 mL，混匀后在 25 ℃水浴中准确反应 5 min，立即用 8 mol/L HCl 0.1 mL 终止反应，并在波长 320 nm 处测定吸光度 (A)值，对照组用 0.5 mL 蒸馏水代替邻苯三酚，同 时设立试剂空白管。
astaxanthin and VC for DPPH radical, hydroxy radical and superoxide anion was detected by spectro -
photometry.
Results:
The
inhibition
and
elimination
rate
of
近年来，人们对虾青素的抗氧化活性进行了
O OH
HO O
图 1 虾青素的分子结构式
广泛的研究。大量实验证明，虾青素在淬灭活性
氧的活性、清除自由基方面能力比 β-胡萝卜素高
收稿日期： 2009-09-03
* 通讯作者
基金项目： 国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD27B06)。
作者简介： 尹蔷(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为食品营养与卫生学。
YIN Qiang1, SHANG Xiao-yu2*, ZHANG Ze-sheng1, SUN Li-na2
(1.College of Food Engineering and Biotechnology of Tianjin University of Science and Techonology, Tianjin 300457; 2.TIENS Group Co. LTD., Tianjin 301700)
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10 倍以上，比 VE 强百倍以上。Naguib[3]利用荧光 测定方法分析虾青素和相关类胡萝卜素的抗氧化 活性发现，虾青素清除过氧化自由基的能力强于 β-胡萝卜素、VE、α-胡萝卜素、叶黄素和番茄红 素。
3 讨论
实验结果表明，虾青素对 DPPH·、·OH 和O2-· 均具有明显的清除作用，且呈量效关系。对比实 验说明，虾青素对·OH 和O2-·的清除效果都比 Vc 明显，在清除 DPPH·自由基方面虽然略低于 Vc， 但同样表现出较高的清除率，当浓度为 90 μg/mL 时，清除率为 95.0%。虾青素之所以对自由基有很 强的清除作用，主要和它的化学结构有关。虾青 素分子结构不仅同其他类胡萝卜素一样具有很长 的共轭双键链，而且在共轭双键链的末端还有不 饱和的酮基和羟基，酮基和羟基又构成 α-羟基 酮。这些结构都具有较活泼的电子效应，能吸引 自由基或向自由基提供电子，从而清除自由基[7]。
紫外可见光光度计：CARY 100，VARIAN 公 司；恒温水浴锅：昆山市超声仪器有限公司；漩 涡式振荡器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；3-18K 离心机：美国 SIGMA 公司。 1.3 方法 1.3.1 虾青素的提取 称量 1 g 的红球藻粉，放入 10 mL 离心管，并放入 3 g 玻璃珠，加入 6 mL 二 甲基亚砜(DMSO)，将离心管放入 45~50 ℃的水浴 中 15 min， 此 期 间 用 漩 涡 器 搅 动 2 ~3 次 ， 以 3800~4200 r/min 离心机旋转 3 min，用吸管将上清 液吸入 25 mL 容量瓶。在离心管中加入 5 mL 丙 酮，剧烈漩涡搅动 30 min，以 3500 r/min离心旋转 3 min，将上清液放到容量瓶中。用丙酮重复提取 4 次后，定容到 25 mL。该红球藻粉中虾青素含量 为 1.35%，以此为根据，将虾青素用无水乙醇稀释 成 5、10、20、40、60、80、100 μg/mL，避光低 温保存备用。 1.3.2 DPPH 自由基的清除能力的测 定 [4] 利 用DPPH·无水乙醇溶液在 517 nm 处有紫色团的特 征吸收峰，以分光光度法测定加入抗氧化剂后， 在 517 nm 处吸光值的下降表示其对 DPPH 自由基 的清除能力。
astaxanthin
to ·OH
and
O
· -
2
was
higher
than
VC.
Although the effect of astaxanthin on eliminating DPPH· radical was slightly lower than VC, but the elimination
Abstract: Objective: To investigate the anti-oxidation activity of astaxanthin and compared with VC. Method:
Free radical scavenging properties were investigated in modified chemical system. The antioxidation activity of
本实验采用一种由雨生红球藻萃取的天然虾 青素粉，通过与 Vc 在清除 DPPH·自由基、羟自由 基和超氧阴离子 3 个方面进行对比，证明虾青素 的强抗氧化性，为虾青素作为抗氧化保健食品的 开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 天然虾青素粉：虾青素含量 1.35，美国西娅
诺泰克公司；DPPH·自由基：美国 SIGMA 公司； 二甲基亚砜、丙酮、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐 酸 、 硫酸铁、水杨酸、过氧化氢、邻苯三酚：天 津市化学试剂一厂，分析纯。 1.2 仪器
rate still high to 95.0% at concentration 90 μg/mL. Conclusion: Astaxanthin has obvious anti-oxidation activity.
Key words: astaxanthin; VC; free radical; anti-oxidation
清除率/%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
图3
Vc 虾青素
20 40 60 80 100 120 浓度/(μg/mL)
虾青素和 Vc 对 O2-·的清除效果
·234·
由图 3 可知，虾青素对O2-·具有明显的抑制作 用，且随着浓度的增加抑制效果增强。与 Vc 的对 比实验可以看出，当浓度为 5 μg/mL 时，虾青素 的清除效果略高于 Vc；当浓度增加到 10 μg/mL 时，虾青素的清除率显著增加，由 24.9％增加到 62.7%，而 Vc 清除率的增加量较低，由 16.8%增 加到 37.7%。当浓度为 100 μg/mL 时，虾青素几乎 完全将O2-·清除，清除率达到 91.1%，而 Vc 对O2-· 的清除率仅为 71.4%。由此可见，虾青素在清除O2·的能力方面要显著强于 Vc。
120
100
80
清除率/%
60
40
Vc
虾青素
20
0 0 图1
20
40
60
80 100
浓度/(μg/mL)
虾青素和 Vc 对 DPPH·的清除效果
2.2 虾青素和 Vc 清除·OH 能力的比较
清除率/%
90
80
70
60
50
Vc
40
虾青素
30
20
0
20 40 60 80 100 120
浓度/(μg/mL)
清除率 S(%)= A0-(Ai-Aj) ×100 A0
2 结果与分析
2.1 虾青素和 Vc 清除 DPPH·能力的比较 由图 1 可知，虾青素和 Vc 对 DPPH·有较高的
清除能力，随着虾青素和 Vc 浓度的升高，它们对
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K(%)= A0-(Ai-Aj) ×100 A0
式中：Ai 为 2 mL DPPH 溶液+2 mL 待测溶液 吸光度； Aj 为 2 mL 待测溶液+2 mL 溶剂的吸光 度； A0 为 2 mL DPPH 溶液+2 mL 溶剂的吸 光度。
1.3.3 清除羟自由基的测定[5] 在试管中依次加入 6 mmoL/L 的 FeSO4 溶 液 2 mL、 1 mL 供 试 液 、 6 mmoL/L 的 H2O2 溶液 2 mL，摇匀，静 置 10 min， 再加入 6 mmoL/L 的水杨酸溶液 2 mL，摇匀，静 置 30 min 后以 5000 r/min离心 10 min，于 510 nm 处测其吸光值。
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DPPH·的清除能力逐渐增强。在 10~80 μg/mL 的 浓度范围内，虾青素和 Vc 对 DPPH·的清除率为 25.9%~95.6%和 10.8%~90.0%，浓度达到 90μg/mL 时，两种抗氧化剂对 DPPH·的清除效果，Vc 的清 除率为 96.1%，而虾青素也已达到 95.0%。在各 浓度梯度下 Vc 对 DPPH·自由基的清除率略高于 虾青素。
清除率 S (%) = A0- (Ai-Aj) ×100 A0
式中：A0 为空白对照； Ai 为提取液的吸光值； Aj 为无水杨酸时提取液的吸光值。
1.3.4 清除超氧阴离子的测定[6] 邻苯三酚在碱 性条件下能迅速自氧化，释放出 O2-·，生成有色的 中间产物，由此邻苯三酚在自氧化过程中出现一 系列颜色变化，可以利用分光光度法进行测量当 有抑制剂存在时，可清除 O2-·，从而阻止中间产物 的积累，根据吸光度数值的变化可求出抗氧化剂 的活性。