上海等级考基因工程限制酶的选择与使用专题训练

一、基因工程三大工具

1、限制性核酸内切酶——剪刀

①定义：可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶

②来源：主要从原核细胞中分离

③作用结果：产生黏性末端或平末端

黏性末端平末端

思考1：

①若想获得一个特定性状的基因，必需要用限制酶切几个切口？产生几个黏性末端

②把两种来源不同的DNA用一种限制酶切割，产生的黏性末端会怎样呢？

2、DNA连接酶——针线

①定义：能将限制酶切割产生的黏性末端之间的缝隙“缝合”起来

②特点：无特异性

3、运载体

①种类：原核生物的质粒，噬菌体，动植物病毒

②运载体必须具备以下条件：DNA分子

能够在宿主细胞中复制并稳定地保存

具有多个限制酶切位点，以便与外源基因连接

具有某些标记基因，便于进行筛选，如抗性基因等

具有复制起点和启动子

③常用的运载体——质粒：小型双链环状DNA分子

二、基因工程流程

1.获取目的基因

通常有以下几种方法获取目的基因：

①从细胞中直接分离

②人工合成：反（逆）转录法；根据已知氨基酸序列合成相应DNA

2.目的基因与运载体重组

①用相应的限制酶切割目的基因及载体，

②将具有相同末端的目的基因和载体用DNA连接酶连在一起，形

成重组DNA分子

思考2：向用同一种限制酶处理后的目的基因和质粒混合物中加入

DNA连接酶，最终得到的重组DNA分子有几种？请用图示表示

下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2 中标注了相关限制酶的酶切位点。

1、转基因技术中通常用图1 中质粒作为载体，质粒的本质是。

2、用图1 中质粒和图2 目的基因构建重组质粒，应选用两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过酶作用后获得重组质粒。

3、若BamH I 酶切的DNA 末端与Bcl I 酶切的DNA 末端连接，连接部位的6 个碱基对序列为

例2、（2019年静安一模）生物工程（12 分）

研究发现，利用抗体抑制肿瘤细胞表面的CD47 蛋白的活性，可促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。为制备抗CD47 抗体，研究人员先利用基因工程方式制备CD47 蛋白，图5 为含CD47基因的外源DNA、质粒DNA 的有关信息，EcoR I、BamH I、Sal I、Xho I 均为限制酶，Kanr、T cr 分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。

1.（2分）为了形成合适的重组质粒，应该选用限制酶________切割外源DNA和质粒DNA。

A．EcoR I 和Xho I B．BamH I 和Xho I C．EcoR I 和Sal I D．BamH I 和Sal I

例3、（2019青浦一模）回答有关基因工程与微生物的问题。（12 分）

利用微生物分解废纸是一种环保的方式，但废纸中的纤维素分子量大不能直接进入酵母菌，且酵母菌无法分解利用环境中的纤维素。为解决这一难题，科学家将纤维素酶基因通过重组质粒导入酵母菌。其所用质粒及其酶切位点如图16，外源DNA 上的纤维素酶基因及其酶切位点如图17。

1.（2 分）图17 中的纤维素酶基因作为________________，质粒作为________________。

2.（2 分）为使纤维素酶基因能够与质粒有效组合，应选用最合适的限制酶是_____________

A. BamH I 和PstI

B. Hind III 和PstI

C. PstI

D. BamHI 和Hind III

3.（2 分）若质粒被HindⅢ限制酶识别的序列是-AAGCTT -，并在A 与A 之间切割。请画出被

切割后所形成的黏性末端。

例4、（2019年崇明一模）（2 分）基因编辑技术所使用的CRISPR/Cas9 系统需要对特定的DNA 序列识别并切割，其功能类似于基因工程工具酶中的。

例5、（2019年金山一模）生物技术及生命科学应用(10 分)

严重联合性免疫缺陷症是一种T 淋巴细胞缺乏腺苷脱氨酶（ADA）引起的疾病，通过基因工程的方法将正常ADA 基因导入患者细胞中进行治疗。图17 分别表示正常ADA 基因、金属硫蛋白基因（含有该基因的细胞能在含重金属镉的培养基中生长）和质粒（总长为3.8kb，1kb=1000 对碱基），ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ均为限制酶。

1.（2 分）为了筛选含有目的基因的受体细胞，需要先将目的基因和标记基因连接形成融合基因。首先用限制酶切割正常腺苷脱氨酶基因与金属硫蛋白基因，然后用DNA 连接酶将它们连接形成融合基因。

2.（2 分）将上述融合基因与图17 中的质粒构建成重组质粒时，应选用的限制酶是。

A．ClaⅠB．SacⅠ和XbaⅠC．ClaⅠ和XbaⅠD．ClaⅠ和SacⅠ

例6、（2019年长宁一模）图17 示基因J 所在的DNA 片段，图18 示质粒的部分碱基序列。（现有 4 种限制酶：Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、EcoRⅠ，能识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、G↓AATTC）。

1.（2 分）据图17、18 分析，过程④（形成重组DNA分子）中不能（宜）使用的限制酶有（多选）。

A. MspⅠ

B. BamHⅠ

C. MboⅠ

D. EcoRⅠ

例7、（2018年宝山二模）回答下列关于遗传信息的表达和生物工程问题（12 分）

图11 为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图12 表示质粒，图13 表示目的基因上的DNA 片段，图14 表示目的基因及限制酶切点。请回答下列问题：

1. 图11 中限制酶EcoRⅠ的特点是。

2. （2 分）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，应该选择的限制酶是

。

课堂作业