组织培养与愈伤组织诱导

实验二组织培养与愈伤组织诱导

一、实验目的：

明确培养基的配制原理；学习诱导茶树外植体形成愈伤组织的方法。

二、实验原理

茶树组织培养的理论依据是茶树细胞具有全能性，所谓细胞全能性是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达，产生出完整植株。要使细胞所具有的全能性表达出来，除了生长以外，还要经过脱分化和再分化等过程。分化了的茶树根、茎、叶细胞，通过脱分化培养可以产生愈伤组织。愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团。愈伤增殖经过进一步的分化培养，提供不同的营养和激素成分，又可再生出完整的小植株。茶树组织培养技术，不仅具有重大的理论意义，而且在茶叶生产实践中已显示了广泛的应用前景。

三、实验材料与用具

用具：超净工作台、培养箱或培养室、剪刀、镊子、手术刀、小烧杯、试剂瓶、培养瓶、酒精灯等。

试剂：酒精、次氯酸钠、无菌水。

四、方法步骤

1.配制培养基：见实验一。

2.外植体消毒

1）将茶树外植体在自来水下冲洗干净，修剪去不需要的部分，剪成适当长度（3～4cm）茎段，然后用棉球沾洗洁剂（洗洁精）擦洗枝条外表，置于含少量洗洁精洗涤30 min，期间用玻璃棒搅拌。用大量水冲洗后置于流水下冲洗30min。

2）用75%的酒精溶液浸泡30s。

3）在超净工作台内，放入5%的次氯酸钠浸泡30min，期间用玻璃棒搅拌（玻璃吸管），后用无菌水冲洗3次以上。

4）对难以消毒的外植体，可再放入0.1%的升汞浸泡5min，期间用玻璃棒搅拌（玻璃吸管），后用无菌水冲洗3次以上。

5）在超净工作台内，放入70%的酒精浸泡20s，快速取出，用无菌水冲洗3次以上。

6）在超净工作台内，用灭菌的镊子夹取外植体放入垫有干无菌滤纸的培养皿中，以吸去多余水分，外植体两端各切去0.2～0.3 cm（切去破裂部分），备用。

7）有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把培养瓶表面擦一下，按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。

**注意：消毒以后的所有操作过程，都应在超净工作台上进行，操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中，使用时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后再切割。

8）轻轻打开瓶盖/塞，将培养瓶口在火焰上方灼热灭菌，同时把长镊子也放在火焰上方

灼烧，将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后将培养皿打开一小缝，用镊子取出切好的外植体放到培养基表面，用镊子轻轻向下按一下，使切片部分进入培养基。在酒精灯火焰上转动培养瓶瓶一圈使瓶口灼热灭菌。然后用盖盖，同时在培养瓶闭写上培养材料、接种日期、姓名等。

9）培养条件：光照12小时，温度25℃±2o C。

**注意：植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素，研究具体问题要设置一定的浓度梯度，以寻找最佳浓度。

五、实验报告

1.结果

在不同外植体愈伤组织的形成及生长状态，包括：颜色大小，紧密的愈伤组织的诱导率：愈伤组织诱导率%=实际形成愈伤组织数/接种外植体数×100

2.思考题

在愈伤组织诱导中应注意哪些问题？