新基因功能研究的策略与方法PPT课件
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• 优势（与ASON比较）：操作简单、投入少、 周期短；用于研究特定基因在特定组织细 胞的特定发育阶段中的功能。
37
细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA在 Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解 开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合 物（RISC）中； 装载了小RNA的RISC复合物就会在 细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的RNA靶 分子；被装载入RISC复合物当中的向导链--ssRNA 随后引导RISC复合物当中的核酸内切酶（ Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列的 mRNA靶分子。
28
细胞及动物水平验证
• 基因过表达细胞模型 • 基因沉默细胞模型
29
基因过表达细胞模型
•定义：通过载体将目的基因转入某一特定细 胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为 的变化，从而了解该基因的功能。 •应用：1）化学法 细胞感染
2）物理法 电穿孔法，效率高 3）生物法 应用病毒基因载体进行 转基因，复制产生病毒蛋白导致机体免疫反 应，从而影响目的基因表达。
31
基因沉默细胞模型
• 原理：采用反义核酸分子抑制、封闭或破 坏靶基因组
• 反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰
32
基因沉默在人细胞作用模式
• 第一种为RNA-RNA 模 型其主要特征是RNA 引导链与RNAPII 合成 的低拷贝转录子结合, 从而导致沉默。
• 第二种为RNA-DNA 模 型其主要特征是在转 录过程中, RNA 引导链 与靶标的一条DNA 形 成二聚体, 从而导致沉 默。
（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、 相似性越高则 Score值越大。
E value:随机匹配的可能性
Identities:匹配上的碱基数占查询到的序列长度的百分比
10
11
DNA序列的开放阅读框查找
预测其编码蛋白质的氨基酸序列
12
13
14
15
• 限制性核酸内切酶切位点 • 外显子、内含子剪切位点分析
34
ASON技术（反义寡核苷酸技术）
是指人工合成能与DNA或RNA互补结合的 特异性寡核苷酸链，使其专一性地抑制基因 表达，以达到调控表达基因的目的。ASON 一般设计在编码区或3’非编码区，长度以 15~20nt较为合适。ASON包括反义DNA和反 义RNA。
35
36
RNAi技术
• 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的 dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达 到阻止基因表达、产生“功能失活”的目 的。
25
研究基因的时空表达模式
• mRNA水平的表达谱分析 • 蛋白水平的表达谱分析
26
mRNA水平的表达谱分析
• Northern Blotting • 原位杂交 • RT-PCR • cDNA微阵列
27
蛋白水平的表达谱分析
• Western Bloting • 免疫组化技术 • 双向凝胶电泳 • 生物质谱技术
21
22
23
• 蛋白跨膜结构分析 • 信号肽预测与识别 • 蛋白质卷曲螺旋预测 • 磷酸化位点预测与识别
24
研究基因的时空表达模式
基因表达的时空性是指基因的表达在个体 发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细 胞类型中均不相同，是有机体发育、分化、 衰老等生命现象的分子基础。
基因表达的时空性特征为基因功能的研究 提供了重要的信息：如果基因在某一特定的 正常组织细胞中的表达水平较高，则往往表 示其在维持正常生理状态中发挥着重要的作 用；而如果基因在相应的病态组织细胞中表 达异常，则提示其可能与该病理过程的发生、 发展有关。
16
蛋白质的理化性质分析
氨基酸组成、分子质量、预测等电点、疏 水性、亲水性、极性、电荷分布等基本理化特性
web.expasy.org/protparam
17
18
19
20
疏水性分析
ExPASy的ProtScale程序
蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等为疏水性氨基 酸，对蛋白质的三级结构有重要影响 可用来计算蛋白质的疏水性图谱
33
反义技术
•原理：指通过碱基互补配对原理，利用人工 或生物合成的特异互补性DNA或RNA片段（或 其修饰产物），干扰基因的解旋、复制、转 录、mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节 ，抑制或封闭靶基因的表达，从而调节细胞 的生长分化等。
•分类：反义寡核苷酸技术（ASON） 核酶技术 小干扰RNA
38
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
39
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
序列具而共同祖先的结论，属于质的判断
序列间的相似性越高，是同源序列可能性就 更高
4
核苷酸序列相似性分析 BLASTn 用查询序列逐一搜索核酸数据库中的 序列
序列决定结构，结构决定功能
氨基酸序列相似性分析 BLASTx 核酸序列翻译成蛋白质之后逐一搜索 蛋白质数据库中的序列
5
6
7wk.baidu.com
8
9
Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基
新基因功能研究的策略与方法
1
目录
• 生物信息学预测 • 研究基因的时空表达模式 • 细胞及动物水平验证
2
生物信息学预测
• 序列相似性分析 • DNA序列的开放阅读框查找 • 蛋白质理化性质分析
3
序列相似性分析
相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系
同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质
30
拟南芥中鉴定到一个F-box 蛋白——AtPP2-B11，在延 长盐处理时间时，其转录 水平和蛋白水平均出现显 著诱导表达。过表达 AtPP2-B11的转基因拟南芥 表现出明显的高盐耐受性 ，而相应的RNA干扰株比 野生株对盐胁迫更敏感。 iTRAQ定量分析显示，在盐 胁迫下有4311个差异表达 蛋白受到AtPP2-B11调控。
37
细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA在 Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解 开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合 物（RISC）中； 装载了小RNA的RISC复合物就会在 细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的RNA靶 分子；被装载入RISC复合物当中的向导链--ssRNA 随后引导RISC复合物当中的核酸内切酶（ Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列的 mRNA靶分子。
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细胞及动物水平验证
• 基因过表达细胞模型 • 基因沉默细胞模型
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基因过表达细胞模型
•定义：通过载体将目的基因转入某一特定细 胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为 的变化，从而了解该基因的功能。 •应用：1）化学法 细胞感染
2）物理法 电穿孔法，效率高 3）生物法 应用病毒基因载体进行 转基因，复制产生病毒蛋白导致机体免疫反 应，从而影响目的基因表达。
31
基因沉默细胞模型
• 原理：采用反义核酸分子抑制、封闭或破 坏靶基因组
• 反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰
32
基因沉默在人细胞作用模式
• 第一种为RNA-RNA 模 型其主要特征是RNA 引导链与RNAPII 合成 的低拷贝转录子结合, 从而导致沉默。
• 第二种为RNA-DNA 模 型其主要特征是在转 录过程中, RNA 引导链 与靶标的一条DNA 形 成二聚体, 从而导致沉 默。
（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、 相似性越高则 Score值越大。
E value:随机匹配的可能性
Identities:匹配上的碱基数占查询到的序列长度的百分比
10
11
DNA序列的开放阅读框查找
预测其编码蛋白质的氨基酸序列
12
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• 限制性核酸内切酶切位点 • 外显子、内含子剪切位点分析
34
ASON技术（反义寡核苷酸技术）
是指人工合成能与DNA或RNA互补结合的 特异性寡核苷酸链，使其专一性地抑制基因 表达，以达到调控表达基因的目的。ASON 一般设计在编码区或3’非编码区，长度以 15~20nt较为合适。ASON包括反义DNA和反 义RNA。
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RNAi技术
• 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的 dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达 到阻止基因表达、产生“功能失活”的目 的。
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研究基因的时空表达模式
• mRNA水平的表达谱分析 • 蛋白水平的表达谱分析
26
mRNA水平的表达谱分析
• Northern Blotting • 原位杂交 • RT-PCR • cDNA微阵列
27
蛋白水平的表达谱分析
• Western Bloting • 免疫组化技术 • 双向凝胶电泳 • 生物质谱技术
21
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• 蛋白跨膜结构分析 • 信号肽预测与识别 • 蛋白质卷曲螺旋预测 • 磷酸化位点预测与识别
24
研究基因的时空表达模式
基因表达的时空性是指基因的表达在个体 发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细 胞类型中均不相同，是有机体发育、分化、 衰老等生命现象的分子基础。
基因表达的时空性特征为基因功能的研究 提供了重要的信息：如果基因在某一特定的 正常组织细胞中的表达水平较高，则往往表 示其在维持正常生理状态中发挥着重要的作 用；而如果基因在相应的病态组织细胞中表 达异常，则提示其可能与该病理过程的发生、 发展有关。
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蛋白质的理化性质分析
氨基酸组成、分子质量、预测等电点、疏 水性、亲水性、极性、电荷分布等基本理化特性
web.expasy.org/protparam
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18
19
20
疏水性分析
ExPASy的ProtScale程序
蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等为疏水性氨基 酸，对蛋白质的三级结构有重要影响 可用来计算蛋白质的疏水性图谱
33
反义技术
•原理：指通过碱基互补配对原理，利用人工 或生物合成的特异互补性DNA或RNA片段（或 其修饰产物），干扰基因的解旋、复制、转 录、mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节 ，抑制或封闭靶基因的表达，从而调节细胞 的生长分化等。
•分类：反义寡核苷酸技术（ASON） 核酶技术 小干扰RNA
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
39
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
序列具而共同祖先的结论，属于质的判断
序列间的相似性越高，是同源序列可能性就 更高
4
核苷酸序列相似性分析 BLASTn 用查询序列逐一搜索核酸数据库中的 序列
序列决定结构，结构决定功能
氨基酸序列相似性分析 BLASTx 核酸序列翻译成蛋白质之后逐一搜索 蛋白质数据库中的序列
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6
7wk.baidu.com
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Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基
新基因功能研究的策略与方法
1
目录
• 生物信息学预测 • 研究基因的时空表达模式 • 细胞及动物水平验证
2
生物信息学预测
• 序列相似性分析 • DNA序列的开放阅读框查找 • 蛋白质理化性质分析
3
序列相似性分析
相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系
同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质
30
拟南芥中鉴定到一个F-box 蛋白——AtPP2-B11，在延 长盐处理时间时，其转录 水平和蛋白水平均出现显 著诱导表达。过表达 AtPP2-B11的转基因拟南芥 表现出明显的高盐耐受性 ，而相应的RNA干扰株比 野生株对盐胁迫更敏感。 iTRAQ定量分析显示，在盐 胁迫下有4311个差异表达 蛋白受到AtPP2-B11调控。