蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白溶解性的影响

条件下再进行试验，得到醇法大豆浓缩蛋白酶解液的 NSI 为 60. 34% ，水解度为 6. 37% ，水解液基本无苦
味。 2. 2 花生粕的限制性酶解试验与分析
在前面试验的基础上，用 Alcalase 碱性蛋白酶对 花生粕进行水解，但得到的结果不是很理想，发现花
生蛋白与大豆蛋白有较大的差别，因此对花生粕首先 需要进行酶的选择试验，从而确定适用于花生粕水解
QYC 200 恒温摇床，PHS-3C 型精密 pH 计，LD42A 离心机，电子天平，恒温磁力搅拌器，GB11240-89 电 热恒温水浴锅，101 － 2 型电热鼓风干燥箱，KSW － 5 － 12A 电炉温度控制器，SX2 － 2 － 5 － 10 箱式电阻炉。 1. 3 测定方法 1. 3. 1 醇法大豆浓缩蛋白和花生粕的限制性酶解［7］
溶解性是蛋白质最基本的物理性质之一。一般 来说，蛋白质要有好的功能性，它必须有较高的溶解 性，因此提高大豆蛋白和花生蛋白的溶解性具有非常 重要的意义［6］。
1 材料与方法
1. 1 材料 醇法大豆浓缩蛋白（ 益海集团） ，花生粕（ 龙大植
第一作者： 硕士研究生（ 涂顺明教授为通讯作者） 。 收稿日期： 2010 － 07 － 30
大豆和花生都是重要的油料作物，在提取油脂之 后产生的饼粕可采用不同的生产工艺加工出不同种 类的蛋白产品。大豆浓缩蛋白是大豆蛋白产品中重 要的产品之一，其蛋白质含量介于大豆分离蛋白和大 豆蛋白粉之间，产品包括酸法和醇法两大类，其中醇 法是通过乙醇浸提法生产大豆浓缩蛋白，生产中没有 污水排放且成本较低，是目前生产大豆浓缩蛋白常用 的方法之一。但是，由于乙醇对蛋白质强烈的变性作 用，致使醇法浓缩蛋白的溶解度显著降低（ 通常 NSI ＜ 10% ） ，产品功能性较差，难以在饮料、乳品、特膳 食品、肉制品等各种食品中应用，因而大大限制了醇 法大豆浓缩蛋白的应用范围［1］。本研究通过酶的限 制性水解来提高醇法大豆浓缩蛋白的溶解度，对其扩 大应用范围有十分重要的意义［2 － 3］。此外，在我国大 约有 50% ～ 60% 的花生用于榨取花生油，榨油同时 产生大量花生粕。花生粕含有丰富的蛋白质和膳食 纤维，具有较高的利用价值，但目前对其的研究和利 用较少，一般用作饲料［4 － 5］。
（ 4） 在温度为 50 ℃ 、底物浓度 10% 、酶用量 1% （ 占底物） 、水解时间为 4h、pH 值分别为 6、7、8 条件 下用 Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得到 结果如图 6 所示。
图 3 酶用量对花生粕水解产物 NSI 的影响
（ 2） 在温度为 50 ℃ 、底物浓度 10% 、pH7、酶用 量 1% （ 占底物） 、水解时间分别为 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 条件下，用 Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生 粕，得到结果如图 4 所示。
物油有限公司） ，Alcalase 碱性蛋白酶（ Novozymes 公 司） ，木 瓜 蛋 白 酶、Validase FP concentrate 蛋 白 酶、 Validase BNP L 蛋白酶（ DSM 公司） ； 甲醛、NaOH、酚 酞、CuSO4 、K2 SO4 、硼 酸、甲 基 红、溴 甲 酚 绿、HCl、 H2 SO4 等均为市售，分析纯试剂。 1. 2 主要试验仪器
（ 2） 在 pH8 水解条件下，经多次单因素实验，设 计了底物浓度、时间、酶用量、温度 4 个参数的正交试 验值，其优化试验设计及正交结果见表 1。
表 1 酶解条件优化的正交试验结果
试验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 极差 R
A 底物 浓度 /% 1（ 5） 1 1 2（ 10） 2 2 3（ 15） 3 3 55. 593 55. 413 51. 677 3. 916
由图 3 可以看出，在酶用量为 0. 4% ～ 1% ，花生
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生产与科研经验
粕水解产物的 NSI 会随着酶用量的增加而逐渐增大， 当酶用量达到 1. 0% 时，NSI 则有所下降，因此，应选 择最佳酶用量为 1% 。
由图 5 可知，在一定的范围内，底物浓度越大，酶 的水解速率越大，这就会通过酶的水解作用使花生粕 中蛋白分子的一些亲水基团释放出来，从而获得比较 高的 NSI。但是随着底物浓度的增加，在不断的反应 过程中，蛋白分子易产生交联聚合现象，从而使 NSI 呈 下降趋势，因此选择底物浓度为 10% 作为最适条件。
生产与科研经验
蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白溶解性的影响
郑芳燕，骆练，刘新征，涂顺明
（ 中国食品发酵工业研究院，北京，100027）
摘 要 为了改善醇法大豆浓缩蛋白和花生粕的溶解性，利用 Alcalase 碱性蛋白酶和 Validase FP concentrate 蛋 白酶对它们进行限制性水解。结果表明，利用 Alcalase 碱性蛋白酶水解醇法大豆浓缩蛋白的最佳水解条件为： 温度 50℃ 、pH 8. 0、水解时间 3h，底物浓度为 10% ，酶浓度为 0. 5% （ 占底物） ，在此水解条件下醇法大豆浓缩蛋 白的氮溶解性指数（ NSI） 由 4. 37% 提高到 60. 34% ，水解度为 6. 37% 。利用 Validase FP concentrate 蛋白酶对花 生粕进行水解时的最佳水解条件为： 温度 50℃ 、pH7. 0、水解时间 4h，底物浓度 10% ，酶浓度 1% （ 占底物） ，在此 水解条件下花生粕的氮溶解性指数（ NSI） 由 42. 40% 提高到 87. 54% ，水解度为 12. 90% 。 关键词 Alcalase 碱性蛋白酶，Validase FP concentrate 蛋白酶，醇法大豆浓缩蛋白，花生粕，溶解性，氮溶解性指 数，水解度
的酶。 2. 2. 1 酶的选择
分别采用如下 4 种酶： Alcalase 碱性蛋白酶、木 瓜蛋白酶、Validase FP concentrate 蛋白酶（ 一种真菌
蛋白酶） 、Validase BNP L 蛋白酶（ 一种细菌蛋白酶） 对花生粕进行水解。参考相关资料以及前期试验得
到各种酶的最适水解条件如见表 2 所示。
表 2 各种蛋白酶的最适水解条件
酶种类
Alcalase 碱性蛋白酶 Validase FP concentrate 木瓜蛋白酶 Validase BNP L
温度 / ℃ 50 50 45 50
底物浓度 / % 10 10 10 10
时间 / h 3 4 3 4
pH 值
8 7 6. 5 7
在各 种 酶 的 最 适 反 应 条 件 下，对 花 生 粕 进 行 水 解，并测定其水解产物的 NSI，结果如图 2 所示。由 图 2 可以看出，利用 Validase FP concentrate 蛋白酶水 解花生粕得到的水解物的 NSI 最高，因此选择 Validase FP concentrate 蛋白酶作为试验用酶。
图 4 水解时间对花生粕 NSI 的影响
由图 4 可知，NSI 在刚开始的 4 h 内，随着时间的 推移而逐渐增大，但是从 4h 之后，NSI 开始有所下 降，原因可能是由于水解过程中产生了较多的疏水基 团，导致蛋白质的水溶性下降。因此选择 4h 为最佳 水解时间。
（ 3） 在温度为 50 ℃ 、pH 值 7、酶用量 1% （ 占底 物） 、水解时间 4h、底物浓度分别为 5% 、10% 、15% 条 件下用 Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得 到结果如图 5 所示。
将醇法大豆浓缩蛋白、花生粕分别溶解于蒸馏水 中，配置成一定浓度的蛋白溶液，调节 pH 到一定的 值，将其放入恒温摇床中在一定的温度下预热 10 min， 加入一定量的已经活化的蛋白酶，在 150 r / min 的速度 下进行水解。水解一定时间后，将酶解液取出，放入 90℃ 的水浴中灭酶 10 min。冷却后，将酶解液在 4 000 r / min 下离心 10 min，取上清液，供分析备用。 1. 3. 2 分析方法
（ 5） 在底物浓度为 10% 、pH 值 7、酶用量 1% （ 占 底物） 、水解时间 4h、温度分别为 40、45、50、55 ℃ 条 件，用 Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得 到结果如图 7 所示。
图 5 底物浓度对花生粕 NSI 的影响
图 7 温度对花生粕 NSI 的影响
%
%
1（ 0. 25） 48. 15
2（ 0. 5）
59. 99
3（ 0. 75） 58. 64
3
56. 89
1
51. 89
2
57. 46
2
53. 96
3
52.பைடு நூலகம்98
1
48. 09
49. 377
57. 137 56. 170 7. 760
最佳组合 A1 B2 C2 D2
由表 1 可以看出，加酶量对醇法大豆浓缩蛋白水 解物的 NSI 影响最大，其次是底物浓度，时间因素影 响不是很明显，各因素作用影响大小排序为： D ＞ A ＞ C ＞ B。最 优 的 理 论 组 合 为 A1 B2 C2 D2 ，在 该 条 件 下 NSI 达到最高，但是由于醇法大豆浓缩蛋白酶解前的 NSI 比较低，因此可以将底物浓度提高至 10% ，在此
图 6 pH 值对花生粕 NSI 的影响
由图 6 中曲线可以看出，当 pH ＜ 7 时，NSI 呈上 升趋势； pH 值从 7 开始下降，原因是酶和底物均有一 定的解离状态，不同的 pH 值范围对它们的解离状态 造成不同程度的影响，进而影响酶和底物之间的结合 程度，并且过酸或者过碱都会影响蛋白酶的构象，甚 至使酶变性失活，因此选择 pH7 值作为最佳水解条 件。
蛋白质的测定用凯氏定氮法（ GB5009. 5） ，水解 产物 NSI 的测定（ GB5511） ，水解度的测定，甲醛滴定 法［8］。
2 结果与分析
2. 1 醇法大豆浓缩蛋白限制性酶水解的实验结果及 分析
（ 1） 以底物浓度为 10% ，酶浓度为 0. 5% （ 占底
2010 年第 36 卷第 10 期（ 总第 274 期） 75
图 2 不同蛋白酶对花生粕水解产物 NSI 的影响
2. 2. 2 Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕酶 解条件的确定
（ 1） 在温度为 50℃ 、底物浓度为 10% 、时间 4 h、 pH 值为 7、酶用量分别为 0. 4% 、0. 6% 、0. 8% 、1% 、 1. 2% （ 占底物） 5 个条件下用 Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得到结果如图 3 所示。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
物） ，水解时间为 3 h，温度为 50℃ ，分别在 pH 为 7、 8、9、10 时进行水解试验，得到水解时 pH 和 NSI 的关 系如图 1 所示。
图 1 水解 pH 值对大豆浓缩蛋白 NSI 的影响
由图 1 中曲线可以看出，当 pH ＜ 8 时，NSI 呈上 升趋势； pH 值从 8 开始 NSI 逐渐趋于平稳，原因是酶 和底物均有一定的解离状态，不同的 pH 范围对它们 的解离状态造成不同程度的影响，进而影响酶和底物 之间的结合程度，并且过酸或者过碱都会影响蛋白酶 的构象，甚至使酶变性失活； 还考虑到酶解产物将在 食品中进行应用，pH 值过高会增加后处理的难度，因 此选择 pH8 为宜。
由图 7 可知，随着温度的升高，水解速度加快，当 升到 50℃ 时，水解度达到顶峰，继续升高温度将抑制 酶的活性甚至失活，使得水解度下降，这是由于反应
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B 时间 / h
1（ 2） 2（ 3） 3（ 4） 1 2 3 1 2 3 53. 000 54. 953 54. 730 1. 953
C 温度 / ℃
1（ 40） 2（ 50） 3（ 60） 2 3 1 3 1 2 52. 863 54. 990 54. 830 2. 127
D 酶用量 / NSI /