蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白溶解性的影响

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蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白溶解性的影响

郑芳燕，骆练，刘新征，涂顺明

（中国食品发酵工业研究院，北京，

100027）摘

要

为了改善醇法大豆浓缩蛋白和花生粕的溶解性，利用Alcalase 碱性蛋白酶和Validase FP concentrate 蛋

白酶对它们进行限制性水解。结果表明，利用Alcalase 碱性蛋白酶水解醇法大豆浓缩蛋白的最佳水解条件为：温度50?、pH 8.0、水解时间3h ，底物浓度为10%，酶浓度为0.5%（占底物），在此水解条件下醇法大豆浓缩蛋白的氮溶解性指数（NSI ）由4.37%提高到60.34%，水解度为6.37%。利用Validase FP concentrate 蛋白酶对花生粕进行水解时的最佳水解条件为：温度50?、pH7.0、水解时间4h ，底物浓度10%，酶浓度1%（占底物），在此水解条件下花生粕的氮溶解性指数（NSI ）由42.40%提高到87.54%，水解度为12.90%。关键词

Alcalase 碱性蛋白酶，Validase FP concentrate 蛋白酶，醇法大豆浓缩蛋白，花生粕，溶解性，氮溶解性指

数，水解度

第一作者：硕士研究生（涂顺明教授为通讯作者）。

收稿日期：2010－07－30

大豆和花生都是重要的油料作物，在提取油脂之后产生的饼粕可采用不同的生产工艺加工出不同种

类的蛋白产品。大豆浓缩蛋白是大豆蛋白产品中重要的产品之一，其蛋白质含量介于大豆分离蛋白和大豆蛋白粉之间，产品包括酸法和醇法两大类，其中醇法是通过乙醇浸提法生产大豆浓缩蛋白，生产中没有污水排放且成本较低，是目前生产大豆浓缩蛋白常用的方法之一。但是，由于乙醇对蛋白质强烈的变性作

用，

致使醇法浓缩蛋白的溶解度显著降低（通常NSI ＜10%），产品功能性较差，难以在饮料、乳品、特膳食品、

肉制品等各种食品中应用，因而大大限制了醇法大豆浓缩蛋白的应用范围

［1］

。本研究通过酶的限

制性水解来提高醇法大豆浓缩蛋白的溶解度，

对其扩大应用范围有十分重要的意义［2－3］

。此外，在我国大约有50% 60%的花生用于榨取花生油，

榨油同时产生大量花生粕。花生粕含有丰富的蛋白质和膳食纤维，具有较高的利用价值，但目前对其的研究和利

用较少，一般用作饲料［4－5］

。溶解性是蛋白质最基本的物理性质之一。一般

来说，蛋白质要有好的功能性，它必须有较高的溶解性，因此提高大豆蛋白和花生蛋白的溶解性具有非常

重要的意义［6］

。

1

材料与方法

1.1

材料

醇法大豆浓缩蛋白（益海集团），花生粕（龙大植

物油有限公司），

Alcalase 碱性蛋白酶（Novozymes 公司），木瓜蛋白酶、Validase FP concentrate 蛋白酶、Validase BNP L 蛋白酶（DSM 公司）；甲醛、NaOH 、酚酞、CuSO 4、K 2SO 4、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、HCl 、H 2SO 4等均为市售，分析纯试剂。1.2

主要试验仪器

QYC 200恒温摇床，PHS-3C 型精密pH 计，LD4-2A 离心机，电子天平，恒温磁力搅拌器，GB11240-89电热恒温水浴锅，

101－2型电热鼓风干燥箱，KSW －5－12A 电炉温度控制器，SX 2－2－5－10箱式电阻炉。1.3测定方法

1.3.1

醇法大豆浓缩蛋白和花生粕的限制性酶解

［7］

将醇法大豆浓缩蛋白、花生粕分别溶解于蒸馏水中，

配置成一定浓度的蛋白溶液，调节pH 到一定的值，将其放入恒温摇床中在一定的温度下预热10min ，加入一定量的已经活化的蛋白酶，在150r /min 的速度下进行水解。水解一定时间后，将酶解液取出，放入90?的水浴中灭酶10min 。冷却后，将酶解液在4000r /min 下离心10min ，取上清液，供分析备用。1.3.2

分析方法

蛋白质的测定用凯氏定氮法（GB5009.5），水解

产物NSI 的测定（GB5511），水解度的测定，甲醛滴定法

［8］

。

2

结果与分析

2.1

醇法大豆浓缩蛋白限制性酶水解的实验结果及分析

（1）以底物浓度为10%，酶浓度为0.5%（占底

物），水解时间为3h ，温度为50?，分别在pH 为7、8、9、10时进行水解试验，得到水解时pH 和NSI 的关系如图1所示。

图1水解pH 值对大豆浓缩蛋白NSI 的影响

由图1中曲线可以看出，当pH ＜8时，NSI 呈上升趋势；pH 值从8开始NSI 逐渐趋于平稳，原因是酶

和底物均有一定的解离状态，

不同的pH 范围对它们的解离状态造成不同程度的影响，进而影响酶和底物

之间的结合程度，并且过酸或者过碱都会影响蛋白酶的构象，

甚至使酶变性失活；还考虑到酶解产物将在食品中进行应用，pH 值过高会增加后处理的难度，因此选择pH8为宜。

（2）在pH8水解条件下，经多次单因素实验，设

计了底物浓度、

时间、酶用量、温度4个参数的正交试验值，其优化试验设计及正交结果见表1。

表1

酶解条件优化的正交试验结果

试验号A 底物浓度/%B 时间/h C 温度/?D 酶用量/

%NSI /%11（5）1（2）1（40）1（0.25）48.15212（3）2（50）2（0.5）59.99313（4）3（60）3（0.75）58.6442（10）12356.895223151.896231257.4673（15）13253.968321352.989

332148.09

k 155.59353.00052.86349.377k 255.41354.95354.99057.137最佳组合

k 351.67754.73054.83056.170A 1B 2C 2D 2

极差R

3.916

1.953

2.127

7.760

由表1可以看出，加酶量对醇法大豆浓缩蛋白水解物的NSI 影响最大，其次是底物浓度，时间因素影响不是很明显，各因素作用影响大小排序为：D ＞A ＞C ＞B 。最优的理论组合为A 1B 2C 2D 2，在该条件下NSI 达到最高，但是由于醇法大豆浓缩蛋白酶解前的NSI 比较低，因此可以将底物浓度提高至10%，在此条件下再进行试验，得到醇法大豆浓缩蛋白酶解液的NSI 为60.34%，水解度为6.37%，水解液基本无苦味。

2.2花生粕的限制性酶解试验与分析

在前面试验的基础上，用Alcalase 碱性蛋白酶对花生粕进行水解，但得到的结果不是很理想，发现花

生蛋白与大豆蛋白有较大的差别，

因此对花生粕首先需要进行酶的选择试验，从而确定适用于花生粕水解

的酶。2.2.1

酶的选择

分别采用如下4种酶：Alcalase 碱性蛋白酶、木

瓜蛋白酶、

Validase FP concentrate 蛋白酶（一种真菌蛋白酶）、

Validase BNP L 蛋白酶（一种细菌蛋白酶）对花生粕进行水解。参考相关资料以及前期试验得

到各种酶的最适水解条件如见表2所示。

表2

各种蛋白酶的最适水解条件

酶种类

温度/?底物浓度/

%

时间/h pH 值Alcalase 碱性蛋白酶501038Validase FP concentrate 501047木瓜蛋白酶45103 6.5Validase BNP L

50

10

4

7

在各种酶的最适反应条件下，对花生粕进行水解，并测定其水解产物的NSI ，结果如图2所示。由图2可以看出，利用Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕得到的水解物的NSI 最高，因此选择Vali-dase FP concentrate 蛋白酶作为试验用酶。

图2不同蛋白酶对花生粕水解产物NSI 的影响

2.2.2Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕酶

解条件的确定

（1）在温度为50?、底物浓度为10%、时间4h 、pH 值为7、酶用量分别为0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%（占底物）5个条件下用Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得到结果如图3所示。

由图3可以看出，在酶用量为0.4% 1%，花生

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粕水解产物的NSI 会随着酶用量的增加而逐渐增大，

当酶用量达到1.0%时，NSI 则有所下降，因此，应选择最佳酶用量为1%。

图3酶用量对花生粕水解产物NSI 的影响

（2）在温度为50?、底物浓度10%、pH7、酶用

量1%（占底物）、水解时间分别为1h 、2h 、3h 、4h 、5h 条件下，用Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生

粕，得到结果如图4所示。

图4

水解时间对花生粕NSI 的影响

由图4可知，NSI 在刚开始的4h 内，随着时间的推移而逐渐增大，但是从4h 之后，NSI 开始有所下降，原因可能是由于水解过程中产生了较多的疏水基团，导致蛋白质的水溶性下降。因此选择4h 为最佳水解时间。

（3）在温度为50?、pH 值7、酶用量1%（占底物）、水解时间4h 、底物浓度分别为5%、10%、15%条件下用Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得到结果如图5所示。

图5

底物浓度对花生粕NSI 的影响

由图5可知，在一定的范围内，底物浓度越大，酶

的水解速率越大，这就会通过酶的水解作用使花生粕中蛋白分子的一些亲水基团释放出来，从而获得比较高的NSI 。但是随着底物浓度的增加，在不断的反应过程中，蛋白分子易产生交联聚合现象，从而使NSI 呈下降趋势，因此选择底物浓度为10%作为最适条件。（4）在温度为50?、底物浓度10%、酶用量1%（占底物）、水解时间为4h 、pH 值分别为6、7、8条件下用Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得到结果如图6所示。

图6pH 值对花生粕NSI 的影响

由图6中曲线可以看出，当pH ＜7时，

NSI 呈上升趋势；pH 值从7开始下降，原因是酶和底物均有一定的解离状态，不同的pH 值范围对它们的解离状态造成不同程度的影响，进而影响酶和底物之间的结合

程度，并且过酸或者过碱都会影响蛋白酶的构象，甚

至使酶变性失活，因此选择pH7值作为最佳水解条件。

（5）在底物浓度为10%、pH 值7、酶用量1%（占

底物）、

水解时间4h 、温度分别为40、45、50、55?条件，用Validase FP concentrate 蛋白酶水解花生粕，得

到结果如图7所示。

图7温度对花生粕NSI 的影响

由图7可知，随着温度的升高，水解速度加快，当

升到50?时，水解度达到顶峰，继续升高温度将抑制

酶的活性甚至失活，使得水解度下降，这是由于反应

初始温度在40 50?时，随着温度的升高，体系的内能增大，反应速度加快；随着温度的不断升高，高于50?时，酶逐渐变性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度。酶反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果，因此应该采用最适的水解温度为50?。通过上述实验，可以得到利用Validase FP con-centrate 蛋白酶水解花生粕的最适水解条件是：底物浓度为10%、pH 值为7、酶用量为1%（占底物）、水解时间为4h 、温度为50?，在此条件下进行试验，得到的花生粕水解产物的NSI 为87.54%，水解度为12.90%，水解液基本无苦味。

3结论

（1）选用Alcalase 碱性蛋白酶对醇法大豆浓缩蛋白进行水解，在单因素分析的基础上进行正交试验，得到了最佳的水解条件：pH 值8，温度50?，酶浓度为0.5%（占底物），反应时间为3h ，底物浓度为10%。在最适条件下，得到水解产物的NSI 由原来的4.37%提高到60.34%，水解度为6.37%，水解液基本无苦味。

（2）在醇法大豆浓缩蛋白限制性酶解的基础上，通过酶的选择，得到了一种真菌蛋白酶Validase FP concentrate 蛋白酶对提高花生粕的溶解性最有意义。通过试验得到最佳水解条件为pH 值7，温度50?，酶浓度为1%（占底物），反应时间为4h ，底物浓度为10%，在此条件下得到的花生粕水解产物的NSI 从原

来的42.40%提高到87.54%，水解度为12.90%，水解液基本无苦味。

（3）利用蛋白酶对醇法大豆浓缩蛋白和花生粕进行限制性酶改性，可以有效提高大豆蛋白和花生蛋白的溶解度，对促进和扩大该类产品在溶解性要求高的饮料等各种食品中的应用有一定的意义。

参

考

文

献

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J ］．中国油脂，2005，30（12）：36－40．Effect of Protease on Solubility of Soy Protein and Peanut Protein

Zheng Fang-yan ，Luo Lian ，Liu Xin-zheng ，Tu Shun-ming

（China National Institute of Food and Fermentation Industries ，Beijing 100027，China ）

ABSTRACT In order to improve the solubility of alcohol leached soybean protein concentrate （ALSPC ）and peanut

meal （PM ），Alcalase and Validase FP concentrate protease were used to limited hydrolyze ALSPC and PM．Results showed that for the Alcalase hydrolyze ALSPC ，the optimum temperature ，pH value ，hydrolysis time ，substrate con-centration and ratio of Alcalase to substrate were 50?，8．0，3h ，10%，0．5%，respectively．Under the said condi-tions ，the nitrogen solubility index （NSI ）of the obtained protein hydrolysate was improved from 4．37%to 60．34%，and the degree of hydrolysis （DH ）is 6．37%．The optimum conditions for the temperature ，pH value ，hydrolysis time ，substrate concentration and ratio of Validase FP concentrate protease to substrate that the Validase FP concen-trate protease hydrolyze PM were 50?，7．0，4h ，10%，1%，respectively．Under these conditions ，the NSI of the ob-tained protein hydrolysate was improved from 42．40%to 87．54%，and the DH is 12．90%．Key words

Alcalase ，Validase FP concentrate protease ，Alcohol leached soybean protein concentrate （ALSPC ），pea-nut meal ，solubility ，nitrogen solubility index （NSI ），degree of hydrolysis （DH ）