溶菌酶的提取和活性测定

实验讲义

溶菌酶的提取和活性测定

南方医科大学药学院

I 溶菌酶的提取和部分纯化

【试验目的】

掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。

【试验原理】

溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。

溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。

从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶

和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。【仪器、材料和试剂】

(一)、仪器

分光光度计

（二）、材料

1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）

2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）

3、新鲜鸡蛋

4、Amberlite阳离子交换树脂

5、氯化钠

（三）试剂

1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。

2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。

3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。【实验步骤】

（一）树脂的再生

Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。在PBS缓冲液平衡12小时以上。（二）蛋清样品的准备

市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。

（三）阳离子交换柱层析

1、吸附

在已平衡好的20ml阳离子交换树脂中加入30ml蛋清样品，搅拌吸附1h。搅拌应缓慢。

2、洗涤

静置，使树脂完全沉淀，去除上清液，树脂用100mlPBS缓冲液（pH7.0）缓慢搅拌洗涤，每次5min，重复三次，以去除未吸附的杂蛋白。

3、装柱及洗脱杂蛋白

将树脂搅拌均匀，装入层析柱内（装柱前，应保证所有接头密闭、管道通畅。装柱时，流速不得超过3ml/min。自此以后各步骤全过程绝对不能出现“流干”现象。）。用含0.05mol/L NaCl 的PBS缓冲液洗涤（pH7.0），以去除与阳离子交换树脂结合不紧密的杂蛋白。同时以0.1mol/L的磷酸缓冲液为对照，用分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度。洗至吸光系数接近0为止（约洗3-5个柱体积）。流速控制为2-3 mL/min。

4、洗脱溶菌酶

用含0.5mol/L NaCl 的PBS缓冲液（pH7.0），以2-3 mL/min的流速洗脱溶菌

酶（约洗5个柱床体积），并分部收集，每管收集2-3ml。收集完成后，以0.5mol/L NaCl 的PBS缓冲液（pH7.0）为对照，用分光光度计测每管收集液在280nm处的吸光度。合并光吸收高峰管，量取体积，置于-20°C冻存备用（标记为样品2）。

II 蛋白浓度和酶活性的检测

【实验目的】

掌握蛋白质浓度的测定方法和溶菌酶活性的测定方法。掌握蛋白质比活性、纯化倍数和回收率的计算。

【实验原理】

考马斯亮兰G250有红、兰两种不同的颜色形式，在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当和蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅和蛋白质浓度高低成正比。

溶壁微球菌是一种革兰氏阳性细菌，对溶菌酶特别敏感。一定浓度的细菌悬液在450nm处对光有一定的吸收值。由于溶菌酶的水解作用，使细菌裂解，浓度降低，细菌悬液的光吸收值减少，据此可以推测溶菌酶的活性。

就像用重量或者摩尔浓度衡量物质的多少一样，通常用酶的活性单位（U）来衡量酶的数量的多少，尤其是衡量不纯的酶的数量。由于不同的酶催化不同的底物发生反应，因此，对于不同的酶，在不同的活性测试系统中，其活性的表示方法不同。常用的酶的活性单位表示在一定时间内催化底物生成产物的多少。对于溶菌酶来说，由于无法直接检测出底物或产物的数量，因此，把它的活性定义为，在特定的实验条件下，每分钟使底物溶液的OD值下降0.001为一个活性单位。

酶的比活力（specific activity）是指每毫克蛋白中所含的酶单位数，用U/mg 蛋白表示。比活力是酶制剂的一个纯度指标，随着酶制剂的逐步纯化，其比活力将逐渐提高。

【仪器、材料和试剂】

(一)、仪器

分光光度计

（二）、材料

1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）

2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）

3、溶壁微球菌（M. lysodeikticus）干粉

4、考马斯亮兰G250

5、牛血清白蛋白

6、88％磷酸

7、95％乙醇

8、蛋清

9、提取纯化的溶菌酶

（三）试剂

1、BSA标准溶液：BSA溶于含0.1mol/L NaCl的0.1M PBS，配置成1mg/mL。

2、考马斯亮兰G－250试剂：100mg考马斯亮兰G－250溶于50ml 95％乙醇中，加入100mL 85％磷酸，混匀，配成原液。使用时，每15mL原液加蒸馏水稀释到100mL，滤纸过滤。

3、测活缓冲液：0.1M的磷酸盐缓冲液，pH6.25。

4、底物溶液：溶壁微球菌溶于测活缓冲液（6mg/ml），用细胞匀浆器研磨1－2分钟，使菌体充分散开，4℃可保存一周。用时，用测活缓冲液（室温）配成0.2mg/ml 工作液，充分混匀，1小时内用完。

【实验步骤】

（一）蛋白浓度的测定

1、制定标准曲线

取14只试管，按下表分两组进行平行操作