酶联免疫分析法优秀课件
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物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质 的量成一定的比例； ⑤加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标 本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。
②碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）
几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝 脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。
AP是一种磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、 磷酸核苷及6-磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐 的同时产生有色的或荧光的产物。
碱性磷酸酶的分子质量为80～100kDa，最适 pH为8.0～10.0，随酶源和底物的不同而变化。
AP活性的测定以对硝基磷酸苯酯（PNP）作为底 物。
用作标记的AP比活力应大于1000U/mg。
③葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）
即β-D-葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉 产生。
它催化O2和β-D-葡萄糖的反应形成H2O2和D-葡 萄糖酸-δ-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。
EC编号 1.11.1.7 3.1.3.2 3.1.3.1 3.2.1.23 1.1.3.4 3.5.1.5 3.5.2.6 1.11.1.6 3.2.1.3 4.2.1.1 3.1.1.7 1.1.1.49 3.2.1.17 1.1.1.49 3.6.1.1 1.3.12.7 2.7.1.40
①辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
提取自辣根中，相对分子质量为44kDa的糖蛋白。 HRP的纯度以RZ值即A403nm/A275nm的值来衡量，
高纯度HRP制剂的RZ≥3.0。 通常以能在20℃、pH为6.0、20s的时间内催化
底物邻苯三酚产生1mg红桔酚（purpurogallin） 作为HRP酶的1个活性单位。 用于标记的HRP比活性应大于250U/mg。
基于抗原-抗体反应的检测技术主要应用 于以下几个方面：
①用已知抗原检测未知抗体；
②用已知抗体检测未知抗原；
③定性或定量检测体内各种大分子物质；
④用已知抗体检测某些药物、激素等各种 半抗原物质。
二、酶标记免疫分析法及常用标记酶 1、免疫分析法分类
2、几种常用酶 （1）对酶的要求
①纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强； ②具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体 蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性； ③使用稳定性和保存稳定性好； ④测定酶活性的方法简便、灵敏、快速； ⑤待测体液中不存在与标记酶相同的酶；
第二节 酶联免疫吸附分析法
( enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)
一、ELISA分析
1、原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； ③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与
固相抗原或固相抗体反应； ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他
具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免
疫反应性的物质被称为半抗原（hapten）。
Ag+Ab Ag-Ab 该免疫反应遵循g] k1 K [Ab][Ag]k2
式中：k1为正反应速率常数；k2为负反应速率 常数；K为反应平衡常数（亲和常数）。
HRP RZ＝OD403nm /OD275nm 酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶或每
1ml酶液所具有的酶活性单位数。
HRP：RZ﹥3活性 >250u/mg，免疫学用；RZ>2 活 性 >180u/mg，临床化学用；RZ>1 活性 >100u/mg， 血糖试纸和尿液分析试纸用
酶 酶联免疫分析来常源用酶
酶联免疫分析法优秀课件
酶联免疫分析法
第一节 酶联免疫分析概述 第二节 光度酶联免疫分析 第三节 发光酶联免疫分析
第一节 酶联免疫分析
一、免疫分析 1、免疫分析发展史 免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待
测物质（抗原或抗体）与其相对应物质（抗 体或抗原）之间专一特异性反应而建立起来 的一种高选择性分析方法。
辣根过氧化物酶
辣根
酸性磷酸酶
动植物
碱性磷酸酶
牛肠
β-D-半乳糖苷酶
大肠杆菌
葡萄糖氧化酶
曲霉菌
脲酶
Jack豆
青霉素酶
—
过氧化氢酶
肝
葡萄糖淀粉酶
根霉菌
碳酸苷酶
牛红细胞
乙酰胆碱酶
—
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
肠系膜明串细菌
溶菌酶
鸡卵白
苹果酸脱氢酶
猪心线粒体
无机焦磷酸酶
大肠杆菌
荧光素酶
发光生物
丙酮酸激酶
哺乳动物组织
当Gal催化水解β-D-半乳糖苷时，若得到的半 乳糖残基转移到水分子受体，称为水解；若 受体是糖或醇时，称为转半乳糖苷。
Gal催化β-D-半乳糖苷水解反应的最适pH为 7.5，转化效率很高，且比HRP易于标记，背 景值低，稳定性好。
Gal 比 活 力 应 不 少 于 30U/mg ， 5℃ 能 保 存 1～2年。
反应最适pH范围为4.0～7.0，pH5.5时，反应 速率最大。葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖的β-异头 碳有高度专一性。
葡萄糖氧化酶的比活力至少为20U/mg。
葡萄糖氧化酶在4℃下可稳定存在6～12个月。
④β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase，Gal）
即乳糖酶（β-lactase），广泛存在于植物、 动物器官、细菌、酵母和真菌中。
免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选 择性化学试剂以分析测定抗原（或抗体）及 半抗原。
2、抗原、抗体与免疫反应
抗原是能够引起免疫反应的分子。
免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫 系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。
具有免疫原性的物质称为免疫原 （immunogen）。
免疫反应原性（immunoreactivity）或抗原性 （antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴 细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。
⑥待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和 其他与酶发生反应的干扰物质；
⑦酶的来源、纯化和供应较方便，价格较 低廉；
⑧均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求 当抗体与半抗原-酶结合物结合后，酶 活性表现出抑制或激活。
（2）酶的评价指标 通常用RZ和酶的比活力评价标记酶的质量。
RZ表示酶的纯度，以酶蛋白中活性部分与非 活性部分最大吸光度的比值。
②碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）
几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝 脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。
AP是一种磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、 磷酸核苷及6-磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐 的同时产生有色的或荧光的产物。
碱性磷酸酶的分子质量为80～100kDa，最适 pH为8.0～10.0，随酶源和底物的不同而变化。
AP活性的测定以对硝基磷酸苯酯（PNP）作为底 物。
用作标记的AP比活力应大于1000U/mg。
③葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）
即β-D-葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉 产生。
它催化O2和β-D-葡萄糖的反应形成H2O2和D-葡 萄糖酸-δ-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。
EC编号 1.11.1.7 3.1.3.2 3.1.3.1 3.2.1.23 1.1.3.4 3.5.1.5 3.5.2.6 1.11.1.6 3.2.1.3 4.2.1.1 3.1.1.7 1.1.1.49 3.2.1.17 1.1.1.49 3.6.1.1 1.3.12.7 2.7.1.40
①辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
提取自辣根中，相对分子质量为44kDa的糖蛋白。 HRP的纯度以RZ值即A403nm/A275nm的值来衡量，
高纯度HRP制剂的RZ≥3.0。 通常以能在20℃、pH为6.0、20s的时间内催化
底物邻苯三酚产生1mg红桔酚（purpurogallin） 作为HRP酶的1个活性单位。 用于标记的HRP比活性应大于250U/mg。
基于抗原-抗体反应的检测技术主要应用 于以下几个方面：
①用已知抗原检测未知抗体；
②用已知抗体检测未知抗原；
③定性或定量检测体内各种大分子物质；
④用已知抗体检测某些药物、激素等各种 半抗原物质。
二、酶标记免疫分析法及常用标记酶 1、免疫分析法分类
2、几种常用酶 （1）对酶的要求
①纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强； ②具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体 蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性； ③使用稳定性和保存稳定性好； ④测定酶活性的方法简便、灵敏、快速； ⑤待测体液中不存在与标记酶相同的酶；
第二节 酶联免疫吸附分析法
( enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)
一、ELISA分析
1、原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； ③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与
固相抗原或固相抗体反应； ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他
具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免
疫反应性的物质被称为半抗原（hapten）。
Ag+Ab Ag-Ab 该免疫反应遵循g] k1 K [Ab][Ag]k2
式中：k1为正反应速率常数；k2为负反应速率 常数；K为反应平衡常数（亲和常数）。
HRP RZ＝OD403nm /OD275nm 酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶或每
1ml酶液所具有的酶活性单位数。
HRP：RZ﹥3活性 >250u/mg，免疫学用；RZ>2 活 性 >180u/mg，临床化学用；RZ>1 活性 >100u/mg， 血糖试纸和尿液分析试纸用
酶 酶联免疫分析来常源用酶
酶联免疫分析法优秀课件
酶联免疫分析法
第一节 酶联免疫分析概述 第二节 光度酶联免疫分析 第三节 发光酶联免疫分析
第一节 酶联免疫分析
一、免疫分析 1、免疫分析发展史 免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待
测物质（抗原或抗体）与其相对应物质（抗 体或抗原）之间专一特异性反应而建立起来 的一种高选择性分析方法。
辣根过氧化物酶
辣根
酸性磷酸酶
动植物
碱性磷酸酶
牛肠
β-D-半乳糖苷酶
大肠杆菌
葡萄糖氧化酶
曲霉菌
脲酶
Jack豆
青霉素酶
—
过氧化氢酶
肝
葡萄糖淀粉酶
根霉菌
碳酸苷酶
牛红细胞
乙酰胆碱酶
—
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
肠系膜明串细菌
溶菌酶
鸡卵白
苹果酸脱氢酶
猪心线粒体
无机焦磷酸酶
大肠杆菌
荧光素酶
发光生物
丙酮酸激酶
哺乳动物组织
当Gal催化水解β-D-半乳糖苷时，若得到的半 乳糖残基转移到水分子受体，称为水解；若 受体是糖或醇时，称为转半乳糖苷。
Gal催化β-D-半乳糖苷水解反应的最适pH为 7.5，转化效率很高，且比HRP易于标记，背 景值低，稳定性好。
Gal 比 活 力 应 不 少 于 30U/mg ， 5℃ 能 保 存 1～2年。
反应最适pH范围为4.0～7.0，pH5.5时，反应 速率最大。葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖的β-异头 碳有高度专一性。
葡萄糖氧化酶的比活力至少为20U/mg。
葡萄糖氧化酶在4℃下可稳定存在6～12个月。
④β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase，Gal）
即乳糖酶（β-lactase），广泛存在于植物、 动物器官、细菌、酵母和真菌中。
免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选 择性化学试剂以分析测定抗原（或抗体）及 半抗原。
2、抗原、抗体与免疫反应
抗原是能够引起免疫反应的分子。
免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫 系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。
具有免疫原性的物质称为免疫原 （immunogen）。
免疫反应原性（immunoreactivity）或抗原性 （antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴 细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。
⑥待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和 其他与酶发生反应的干扰物质；
⑦酶的来源、纯化和供应较方便，价格较 低廉；
⑧均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求 当抗体与半抗原-酶结合物结合后，酶 活性表现出抑制或激活。
（2）酶的评价指标 通常用RZ和酶的比活力评价标记酶的质量。
RZ表示酶的纯度，以酶蛋白中活性部分与非 活性部分最大吸光度的比值。