第五章 蛋白质的修饰

（7）突变基因的鉴定。从选出的噬菌斑中制备DNA，用 Sanger方法测定突变部位序列，与预定序列相符合的就 是所需的突变基因。
2、盒式诱变 合成两套分别与靶DNA的两条链互补的寡核苷酸 （10~25bp）。其中一套由单一的一种与野生型靶DNA 一条链的序列精确互补的寡聚核苷酸组成，另一套由 一系列互补于另一条链同一位置带有目标突变的简并 的寡聚核苷酸组成。这样，在有利于形成错配杂交的 条件下将两条互补的寡聚核苷酸混合，则生成1个短 的双链DNA片段，可在片段的两端设计合适的突变末 端，直接插入到重组质粒中以置换同源的野生型序列。
试剂首先与活性部位发生特异性结合；
然后试剂中的活性基团与活性部位中的侧链基团发 生化学反应，将标记基团共价连接于活性部位上。 修饰有两个明显的特点： （1）底物、竞争性抑制剂或配体对修饰有保护作用； （2）修饰反应是定量定点的修饰。
（2）Kcat型的不可逆抑制剂
是根据酶催化过程设计的，这类抑制剂 具有和底物类似的结构，具有被酶结合和催 化的性质，此外，还有一个潜伏反应基团， 在酶对它进行催化反应时，这个潜伏的反应 基团被酶催化而活化，对活性部位起不可逆 抑制作用。这类抑制剂的专一性很高，常被 人们称为“自杀性底物”。
部位，如酶的活性部位、膜蛋 白质上的激素结合部位等位点 的专一性——亲和标记
1、亲和标记
亲和标记：试剂对蛋白质分子中被修饰的部 位的专一性修饰，称为亲和标记或专一性的 不可逆抑制作用。 亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团 的专一性，而且具有对被作用部位的专一性， 即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不 与被作用部位以外的同类基团发生作用。这 类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。
第五章 蛋白质的修饰
蛋白质的修饰主要包括两个方面：
（1）蛋白质分子的侧链基团的改变（化学 修饰）。 （2）蛋白质分子中主链结构的改变（采取 基因工程的手段，定点突变是改变蛋白质 主链结构的常规操作）。
第一节
蛋白质的化学修饰
蛋白质的化学修饰是指蛋白质分子 化学结构的改变。
修饰的目的用于生物医学和生物技术方面
修饰反应条件： 1、不引起蛋白质的不可逆变性 2、有利于选择性地修饰蛋白质
为此，要控制反应物配比、pH、反应温度、 反应介质。 pH：最重要的条件。一般，增加pH，可提 高反应速率，降低pH，可减小反应速率； 反应活性高的修饰剂可在生理pH下与蛋白 质耦合，反应活性低的修饰剂需提高pH。 T：影响巯基的微环境；适宜的T可减少或防 止竞争的基团的反应；对于热敏性蛋白，需 要在较低的T下进行反应。
3、羧基的化学修饰 蛋白质分子中谷氨酸和天冬氨酸含有羧基， 羧基修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰 胺类。 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质 分子的羧基基团，可以在比较温和的条件下 进行，目前已成为一种应用最普遍的标准方 法。
二、蛋白质位点专一性修饰 蛋白质修饰专一性：
基团修饰专一性：
位点修饰专一性：
二、基因融合
融合蛋白经合适的表达系统表达后，即可 获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型 多功能蛋白。构建融合蛋白的基本原则是：第 一个蛋白质基因的终止密码子删除，再接上带 有终止密码子的第二个蛋白质或多肽基因，即 可实现两个基因的融合表达。
三、tRNA介导定点搀入非天然氨基酸
பைடு நூலகம்
基本过程：
（1）首先将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录 的载体中； （2）利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将为特定 氨基酸编码的密码子（如图AGC）突变成无义密码 （TAG）； （3）利用run off转录或化学/酶法反密码子环取代法 合成相应的校正tRNA，并用T4RNA连接酶通过PdCpA-非 天然氨基酸，将非天然氨基酸连到校正tRNA上。 码子，将非天然氨基酸搀入到蛋白质分子的特定位点。
步骤如下： （1）将待突变的目的DNA片段克隆于M13噬菌体载体。 （2）从重组M13噬菌体中制备单链DNA。 （3）合成含有预定突变的寡核苷酸诱变引物，其中间 部位是预定的突变序列，两端是互补区（与目的基因 诱变部位两侧的序列正确配对）。 （4）诱变寡核苷酸与靶DNA杂交并利用DNA聚合酶进行 延伸，生成异源双链M13DNA。
（2）标记试剂应易于合成，放射性标记的光 亲和试剂的合成尤为重要。 （3）光亲和标记试剂在反应后基本不引起或 很少导致蛋白质的构象变化。
（4）在某一光波下进行光亲和标记反应时， 不应破坏其他生物分子体系如蛋白质、核酸。 设计亲和标记方案时应考虑激活反应的光的波 长不小于300nm。 （5）光亲和标记的反应中间物应该是高活性。 （6）高反应活性的中间物能够和受体蛋白质 最终形成稳定的共价结合产物。
基团专一性与位点专一性的区别 基团专一性试剂 不仅可与活性部 位的基团发生反 应，也可以与活 性部位以外的基 团发生反应。 亲和标记试剂只 专一性作用于蛋 白质的特定部位 如活性部位的侧 链基团。
蛋白质修饰专一性：
基团修饰专一性： 试剂对被修饰的基团的专一性
位点修饰专一性：试剂对蛋白质分子中被修饰的
（4）通过体外转录体系，产生在特定位点突变成 UAG的mRNA （5）通过体外翻译体系，借助携带有非天然氨基 酸的校正tRNA上的反密码子，通读mRNA上的UAG无 义密码子，将非天然氨基酸搀入到蛋白质分子的 特定位点。
一、蛋白质侧链基团的修饰反应
通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分 子侧链上的特定功能基团发生化学反应。
酰化及其相关反应 氧化还原反应
烷基化反应
芳香环取代反应
1、蛋白质修饰反应的类型
（1）酰化及其相关反应
这类化学修饰剂为乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸 酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，它 们在室温，pH4.5~9条件下可与蛋白质分子侧链的 氨基、羟基、巯基及酚基发生酰基化反应。
蛋白质主链结构的化学修饰
基因突变和基因融合
一、基因突变
定点诱变
定点诱变分为三类： （1）通过寡聚核苷酸介导的基因诱变； （2）盒式诱变或片段取代诱变； （3）利用聚合酶链式反应，以双链DNA为 模板进行的基因诱变。
1、通过寡聚核苷酸介导的基因诱变 通过添加、删除、置换DNA序列上的核苷酸， 特异地产生个别氨基酸的突变
2、光亲和标记的一般原理 光亲和标记试剂在暗条件下，只能与蛋 白质的活性部位发生专一性的非共价结合， 形成1个复合物。只有在光照的情况下，试剂 被激活，产生1个非常活泼的反应官能基团， 这个官能基团立即与附近活性部位的氨基酸 残基的侧链基团发生反应，形成一个共价的 标记物。
3、光亲和标记试剂具备的特点： （1）光亲和标记试剂在黑暗中应是化学惰性 物质，标记反应中所有的实验条件，如T、pH、 试剂的氧化电位等都不能破坏光亲和修饰反 应的前体。
（4）芳香环取代反应
氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取 代的碘化和硝化反应，如四硝基甲烷可以作用于酪 氨酸的酚羟基，形成3-硝基酪氨酸的衍生物，这种 产物有特殊的光谱，可用于直接定量测定。
2、各种侧链的化学修饰 巯基的化学修饰 氨基的化学修饰
羧基的化学修饰
吲哚基的化学修饰 酚羟基的化学修饰 胍基的化学修饰
亲和标记又称为专一性的不可逆抑制作用。 可用于亲和标记的抑制剂有：
Ks型的不可逆抑制剂
Kcat型的不可逆抑制剂
（1）Ks型的不可逆抑制剂
这类具有和底物结构相似的结合基团，因此它 可以与活性部位发生特异性结合，同时还具有一个 活泼的反应基团，能和活性部位氨基酸残基的侧链 基团进行修饰反应。
反应包括两步：
（5）双链M13DNA的富集，可用超离心、凝胶电泳等手 段。将上述反应混合物中的双链M13DNA部分纯化、富集。
（6）含突变基因的M13噬菌体的筛选。将合成的双链 DNA转化为大肠杆菌F+菌株。用上述诱变引物做成标记 探针，对转化产生的噬菌斑在不同温度下杂交，选出表 现阳性的噬菌斑克隆，它们可能含有所要求的诱变基因。
1、光亲和标记
光亲和标记是亲和标记中极其重要的一类。
光亲和标记试剂，在结构上除了有一般亲 和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。
1、光亲和标记反应过程
第一步，试剂与蛋白质的活性部位在暗条 件下发生特异性结合； 第二步，光照，试剂被光激活后，产生1个 高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链 基团发生反应。
4、光亲和标记的优点： （1）光亲和标记试剂在暗条件下呈化学惰性 物质。
（2）通过光照很容易控制其标记的程度、标 记速度。
（3）光反应产物的中间产物具有高活性，可 以标记在一般情况下反应活性很低的疏水残基 和亲核氨基酸残基。也就是说，蛋白质的所有 氨基酸残基极化都可以被标记。
第二节
蛋白质的分子生物学改造
如果在重组质粒中目的序列两端无合适的限制性内 切酶位点，可用定点诱变的方法引入，要求引入的 酶切位点对载体质粒是单一的，而且对目的基因编 码没有影响。这样，含有目的突变的一系列盒式双 链片段可以按需要在目的基因上任意置换，引入需 要的突变。
3、PCR 如果已获得蛋白质分子的cDNA基因，可设计1对引 物，通过PCR扩增出非全长cDNA基因，缺失的序列由 引物与模板DNA的配对位置决定。如果在两条引物上 分别引入基因上并不存在的限制性内切酶位点，可以 方便地将缺失的基因克隆到合适的表达载体上。合成 若干套这样的引物，通过PCR扩增并克隆于表达载体， 可获得若干套缺失突变体。也可以在引物上设计转录 及翻译调控序列，利用体外转录——翻译系统表达相 应的蛋白质。
1、巯基的化学修饰
是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺，在蛋白质 的氨基酸组成分析和测序前，通常要用碘乙酸来使巯 基羧甲基化，防止半胱氨酸的降解，而且羧甲基化的 半胱氨酸很容易被氨基酸分析仪所识别。
N-乙基马来酰亚胺修饰反应具有较强专一性并伴随 光吸收的变化，可以通过光吸收的变化确定反应的程度。 5，5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DNTB）是目前最常 用的巯基修饰试剂，与巯基反应形成二硫键，使蛋白质 分子上标记一个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放 一个有很强衍射的TNB阴离子，该阴离子在412nm具有很 强的吸收，可以通过光吸收的变化来监测反应程度。
2、氨基的化学修饰
赖氨酸ε-氨基：三硝基苯磺酸（TNBS）就是 其中非常有效的一种，TNBS与赖氨酸残基反应， 在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。 在蛋白质序列分析中，首先必须测定整个肽链 的N-末端和C-末端残基，用于多肽链N-末端残 基的测定的化学修饰方法常用：2，4-二硝基 氟苯法、丹磺酰氯法、苯异硫氰酸酯法。
（2）烷基化反应
修饰剂常带有活泼的卤素原子，很容易使蛋白质 分子的亲核基团如氨基、巯基、羧基、硫醚基和 咪唑基发生烷基化，这类试剂有2，4-二硝基氟苯、 碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤化物和碘甲烷 等。
（3）氧化和还原反应
如H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺能将侧链基团氧化， 易受氧化的侧链基团有巯基、硫醚基、吲哚基、 咪唑基以及酚基等。 还原剂主要作用于二硫键，如2-巯基乙醇、巯基 乙酸和二硫苏糖醇（DTT）等。
亲和标记修饰剂一般都是底物、别 构效应物和配体（如辅酶等）的结 构上的类似物，因此这类修饰试剂 对蛋白质的活性部位具有高度的亲 和性。
设计亲和标记要满足两个条件: （1）亲和试剂应当对活性部位专一性地 结合。 （2）亲和试剂必须含有能与某些氨基酸 残基起反应的化学基团。在适宜的条件 下，反应只能在活性部位上及其附近的 氨基酸残基上进行。