8.1-2 凝胶色谱与离子交换色谱解析
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
→多用于凝胶渗透色谱（GPC）中
商品为Styrogel
14
2）聚丙烯酰胺凝胶 商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH N,N’-亚甲基双丙烯酰胺
CH2=CH
C=O NH2
丙烯酰胺
15
16
聚丙烯酰胺凝胶
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 部 分 结 构
8.1 凝胶色谱
Size Exclusion/Excluding Chromatography(SEC)
Gel Filtration Chromatography(GFC)
Gel Penetration Chromatography(GPC)
1Βιβλιοθήκη Baidu
8.1.1、凝胶色谱原理
以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动 相中所含各组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一 种色谱技术。
①Vo的测定
选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶
滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱 峰峰顶洗出的体积就是该柱的Vo值。
②Vi的测定
选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其 洗脱体积Vei，减去Vo就是该柱的Vi 。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收 的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定Vi。
• 大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之 外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。 • 化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色 谱法达到完全的分离纯化的目的。
3
• 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又
可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 • GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶 的代表是葡聚糖系列，洗脱溶剂主要是水。 • GPC主要用于分离测定有 机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、 聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)的分子量和分子量
2
• 凝胶的孔隙大小分布有一定范围（Φmin～ Φmax ） • 若Φ分子＞ Φmax →全部被排阻在凝胶颗粒之外→全排阻 • 两种全排阻的分子即使大小差别很大，也不能有分离效果 • 若Φ分子＜ Φmin→能进入凝胶的全部孔隙。
• 如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差 别，也不会有好的分离效果。
• 理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性， 能够耐受高温高压、强酸强碱、高化学惰性、颗粒 大小均一度高的珠状颗粒。
11
凝胶色谱介质
• 可分为合成树脂以及多糖类衍生物两类
1）苯乙烯、丙烯酰胺、聚乙烯醇→打开不饱合键而发生共
聚作用
2）单糖间通过糖苷键发生缩聚→多糖如纤维素、葡聚糖、
琼脂糖等
• →聚合大都仅能得到线性聚合物，小分子量时可溶于
(Bio-Gel P)
17
聚丙烯酰胺凝胶
18
3）聚乙烯醇系凝胶
• 以交联聚乙烯醇为骨架的SEC介质，典型产品为日本 TOSOH 拓索公司的Toyopearl
• 大分子链上有丰富的-OH→骨架具有高度亲水性，方便进行 化学改性，生物相容性好
19
2、多糖类
• 1）葡聚糖系 • 2）琼脂糖系
20
1）葡聚糖 (Sephadex)系凝胶
Kd = 0，Ve = Vo （分子体积大，完全排阻） 0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化 Kd = 1，Ve=Vo十Vi （分子体积小，
完全在凝胶颗粒内部扩散）
8
凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit): 不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。 （2）分级范围（fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质 的相对分子质量范围。Sephadex G-50的分级范围为1.5 -30kD.
9
（3）溶胀率：
溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀 率，即
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
交联葡聚糖凝胶（Sephadex）简介 商品名
Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型 号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶持水量 的10倍，数字越小，交联度越大，网孔越小，持水量越小。
③Vt的测定
D 2 Vt （ ） h 2
式中，π为常数3.14，D为柱直径，h为凝胶床的高度。
6
分配系数（Kd）
Ve＝Vo十KdVi
Ve：洗脱体积，自样 品加入到组分最大浓 度(峰)出现时所流出的 容积；
(V e V o ) Kd Vi
7
(V e V o ) Kd Vi
葡 聚 糖 凝 胶 部 分 结 构
(Sephadex)
商品名为Sephadex G类
21
蔗糖在葡聚糖酶的作用 下发酵，产生葡聚糖 （glucosan），相对分子 质量很高。但经酸水解的 作用，可以分解为较小的 分子，平均相对分子质量 为 4×104～20×104。结 构上大部是以 α-1，6-糖苷 键聚合，有少量的分支。 这个聚合体（Dextran）若 用环氧氯丙烷处理，就发 生所谓的交联作用，形成 一个网状的分子，这叫作 交联葡聚糖（sephadex）， 结构如下式：
Sephadex G50 的溶胀率为500%30%。
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。 粒径越小，分离效率越高。
10
8.1.3、凝胶色谱介质
• SEC介质的要求
• 基于凝胶过滤层析的原理，对其介质的最基本要求： 不能与原料组分发生除排阻外的任何其他相互作用， 如电荷作用、化学作用、生物学作用等
水，要想得到具有一定强度的凝胶介质，还需将线性聚合 物通过交联反应，形成一定的凝胶网络结构 • 控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多， 孔隙越小。
12
1、合成树脂类
13
1）传统介质—— 聚苯乙烯与二乙烯苯交联共聚物
交联度越高，凝胶溶胀时体积变化越小
聚苯乙烯树脂的疏水特性常使蛋白质变性
分布，常用的凝胶为聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等
有机溶剂。
4
8.1.2、凝胶色谱理论
Vt ：柱床总体积 Vo：柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积 Vg：干凝胶颗粒体积 Vi =g（干凝胶质量）×Wr（凝胶单位吸水量） Vt＝Vo十Vi十Vg
5
Vo、Vi、Vt的测定
商品为Styrogel
14
2）聚丙烯酰胺凝胶 商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH N,N’-亚甲基双丙烯酰胺
CH2=CH
C=O NH2
丙烯酰胺
15
16
聚丙烯酰胺凝胶
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 部 分 结 构
8.1 凝胶色谱
Size Exclusion/Excluding Chromatography(SEC)
Gel Filtration Chromatography(GFC)
Gel Penetration Chromatography(GPC)
1Βιβλιοθήκη Baidu
8.1.1、凝胶色谱原理
以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动 相中所含各组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一 种色谱技术。
①Vo的测定
选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶
滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱 峰峰顶洗出的体积就是该柱的Vo值。
②Vi的测定
选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其 洗脱体积Vei，减去Vo就是该柱的Vi 。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收 的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定Vi。
• 大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之 外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。 • 化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色 谱法达到完全的分离纯化的目的。
3
• 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又
可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 • GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶 的代表是葡聚糖系列，洗脱溶剂主要是水。 • GPC主要用于分离测定有 机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、 聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)的分子量和分子量
2
• 凝胶的孔隙大小分布有一定范围（Φmin～ Φmax ） • 若Φ分子＞ Φmax →全部被排阻在凝胶颗粒之外→全排阻 • 两种全排阻的分子即使大小差别很大，也不能有分离效果 • 若Φ分子＜ Φmin→能进入凝胶的全部孔隙。
• 如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差 别，也不会有好的分离效果。
• 理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性， 能够耐受高温高压、强酸强碱、高化学惰性、颗粒 大小均一度高的珠状颗粒。
11
凝胶色谱介质
• 可分为合成树脂以及多糖类衍生物两类
1）苯乙烯、丙烯酰胺、聚乙烯醇→打开不饱合键而发生共
聚作用
2）单糖间通过糖苷键发生缩聚→多糖如纤维素、葡聚糖、
琼脂糖等
• →聚合大都仅能得到线性聚合物，小分子量时可溶于
(Bio-Gel P)
17
聚丙烯酰胺凝胶
18
3）聚乙烯醇系凝胶
• 以交联聚乙烯醇为骨架的SEC介质，典型产品为日本 TOSOH 拓索公司的Toyopearl
• 大分子链上有丰富的-OH→骨架具有高度亲水性，方便进行 化学改性，生物相容性好
19
2、多糖类
• 1）葡聚糖系 • 2）琼脂糖系
20
1）葡聚糖 (Sephadex)系凝胶
Kd = 0，Ve = Vo （分子体积大，完全排阻） 0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化 Kd = 1，Ve=Vo十Vi （分子体积小，
完全在凝胶颗粒内部扩散）
8
凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit): 不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。 （2）分级范围（fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质 的相对分子质量范围。Sephadex G-50的分级范围为1.5 -30kD.
9
（3）溶胀率：
溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀 率，即
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
交联葡聚糖凝胶（Sephadex）简介 商品名
Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型 号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶持水量 的10倍，数字越小，交联度越大，网孔越小，持水量越小。
③Vt的测定
D 2 Vt （ ） h 2
式中，π为常数3.14，D为柱直径，h为凝胶床的高度。
6
分配系数（Kd）
Ve＝Vo十KdVi
Ve：洗脱体积，自样 品加入到组分最大浓 度(峰)出现时所流出的 容积；
(V e V o ) Kd Vi
7
(V e V o ) Kd Vi
葡 聚 糖 凝 胶 部 分 结 构
(Sephadex)
商品名为Sephadex G类
21
蔗糖在葡聚糖酶的作用 下发酵，产生葡聚糖 （glucosan），相对分子 质量很高。但经酸水解的 作用，可以分解为较小的 分子，平均相对分子质量 为 4×104～20×104。结 构上大部是以 α-1，6-糖苷 键聚合，有少量的分支。 这个聚合体（Dextran）若 用环氧氯丙烷处理，就发 生所谓的交联作用，形成 一个网状的分子，这叫作 交联葡聚糖（sephadex）， 结构如下式：
Sephadex G50 的溶胀率为500%30%。
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。 粒径越小，分离效率越高。
10
8.1.3、凝胶色谱介质
• SEC介质的要求
• 基于凝胶过滤层析的原理，对其介质的最基本要求： 不能与原料组分发生除排阻外的任何其他相互作用， 如电荷作用、化学作用、生物学作用等
水，要想得到具有一定强度的凝胶介质，还需将线性聚合 物通过交联反应，形成一定的凝胶网络结构 • 控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多， 孔隙越小。
12
1、合成树脂类
13
1）传统介质—— 聚苯乙烯与二乙烯苯交联共聚物
交联度越高，凝胶溶胀时体积变化越小
聚苯乙烯树脂的疏水特性常使蛋白质变性
分布，常用的凝胶为聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等
有机溶剂。
4
8.1.2、凝胶色谱理论
Vt ：柱床总体积 Vo：柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积 Vg：干凝胶颗粒体积 Vi =g（干凝胶质量）×Wr（凝胶单位吸水量） Vt＝Vo十Vi十Vg
5
Vo、Vi、Vt的测定