生化实验01-蛋白质含量的测定

1.0mL
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
0
5mL，混匀后室温下放置5~10min
0.5mL（逐一加入并立即混匀），20~30min后，测定
A650
6
比色测定：
1号管为空白，在650nm波长下用10mm光程的比色皿测定各管 的吸光度。
标准曲线绘制：
以每管标准蛋白含量（μg）为 横坐标，吸光度（A650）为纵坐标 ，在坐标纸上绘制出标准曲线。
-3
T1
T1
T1
-1
-2
-3
3个技术重复
T2
T2
T2
-1
-2
-3
T3
T3
T3
-1
பைடு நூலகம்
-2
-3
9
五、原始数据
A650的记录
管号
12 34 5
标准蛋白 0 50 100 150 200
含量 (μg)
A650
W=
VT=
VS=
测定-1 测定-2 测定-3
N=
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六、结果计算
• 标准曲线的绘制： 1、坐标纸绘制 2、在excel中绘制并求
出回归方程
A650
0.3 0.2 0.1
50 100 150 200
蛋白质含量（ μg ）
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X：根据样品的吸光值查得的蛋白质含量（ μg ）； X1= , X2= ，X3= ，X平均=
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样品中蛋白质的含量（mg/g）＝
X VT N W VS 1000
X：根据样品的吸光值查得的蛋白质量（μg）； VT：提取液总体积（mL）； Vs：测定时取用的样品体积（mL）； W：样品鲜质量（g）； N：样品稀释倍数）
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七、注意事项
1. 试剂乙在碱性环境中不稳定。 2. 酚类、柠檬酸、还原性糖类等物质有干扰。
八、分析与讨论
14
8
重现（复）性、严谨性、透明性和独立验 证是科学方法的基石
• 生物重复（ biological repeats）
• 实验重复或技术重复（technical repeats）
对照组
3个生物重复
处理组
R1
R2
R3
T1
T2
T3
R1 R1 R1
-1
-2
-3
R2 R2 R2
-1
-2
-3
R3 R3 R3
-1
-2
（三）试剂 1. Folin试剂甲-- 试剂A：试剂B = 50：1(V/V) 现配现用 2. Folin试剂乙（已配制） 3. 标准蛋白质溶液： 250 µg/mL。
5
四、实验步骤
（一）标准曲线的制作
管号
1
2
3
4
5
样品溶液
标准蛋白溶液 (mL)
蒸馏水 (mL) 试剂甲 试剂乙
0
0.2 0.4 0.6 0.8
3
1. Folin—酚试剂法的特点 （1）灵敏度高：比双缩脲法高100倍。 （2）适用范围：微量蛋白质（0.02～0.50mg/mL）测定.
2. 干扰因素： 酚类、柠檬酸和巯基类化合物等还原性物质会导致测
定结果偏高。
4
三、材料、设备与试剂
（一）实验材料 绿豆芽下胚轴
（二）设备 天平；分光光度计；移液器等。
一、实验目的
了解、掌握可溶性蛋白质测定的常用方法。
2
二、实验原理
Folin-酚试剂法（Lowry法）结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋 白质的反应。
第一步反应：在碱性条件下，蛋白质的肽键与铜结合生成紫 红色的蛋白质-铜络合物(双缩脲反应)；
第二步反应：此络合物及蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸等使 磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深 蓝色混合物质，其颜色深浅与蛋白质含量成正相关，在650nm下比 色测定即可进行定量测定。
实验室规章制度
• 实验室安全（人身安全、财产安全、环境安全） • 规范操作（2人/组，每人必须动手做实验) • 实验室卫生（仪器、试剂、器皿、桌面，值日生） • 实验报告（完整、规范，原始数据，结果分析讨论） • 不能迟到早退，不能在实验室吃东西
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实验01 植物组织中蛋白质含量的测定 （Folin—酚试剂法）
A650 0
蛋白质(µg)
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（二）样品中蛋白质的提取及测定
0.2～0.5g绿豆芽下胚轴于研钵中 —→加1~2mL水—→研 磨、匀浆后定容至25mL —→室温下放置10~20min（间歇振 荡） —→过滤后得到待测样品溶液。
分别取样品待测液1.0mL于3支试管中（3次重复）进行 显色、测定（参考制作标准曲线的步骤）。