异源基因表达系统

大肠杆菌表达载体类型及其进展
大肠杆菌表达载体的类型：
1.
非融合表达载体
2.
融合表达载体
3.
分泌表达载体
4.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
带纯化标签的表达载体
5.
带伴侣蛋白的表达载体
6.
表面呈现表达载体
（1） 非融合表达载体
其优越性在于，表达的非融合蛋白与天然状态下 存在的蛋白质结构、功能以及免疫原性等方面基本一 致，从而可以进行后续研究，而某些医药方面的产品 则可以推向临床。
异源基因表达系统
杨力媛 班级：生工所
背景
1980年异源基因表达技术逐渐成为一门 科学，相关技术的突破性进展以惊人的速 度不断出现。
在初期，大多数技术上相关的基础领域 有快速的发展，然后慢慢变为平稳，但成 果仍然显著。在接着的发展进程中不时会 有小的突破。
表达载体的基本要求
• 表达系统的核心是表达载体。一般说来，大肠杆 菌表达载体应满足以下要求 ： 1表达量高； 2适用范围广； 3表达产物容易纯化； 4稳拦性好。 迄今为止，还投有一个表达载体能完全满足上述 要求，因此，近年来出现了一些新型载体，可满 足不同目的的需要。
原核生物中表达真核基因产物
•大肠杆菌仍然是异源基因产物表达的热门宿主。 尽管有多年的大量实验室经验，当在原核生物中
表达真核基因产物时，与产物质量相关的争论依然存 在。 •大肠杆菌的密码子偏爱性与哺乳动物系统有很大不同， 当在这种细菌中尝试表达哺乳动物基因产物时会出现 问题。
密码子的遗传背景
基因表达中的主要影响因素现在已经非常清楚。 稀有密码子聚类能够导致核糖体的暂停和移码，
•虽然该方法改进了生产哺乳动物基因产物的能力，但并不是 万能的。产物溶解性和二硫桥正确的排列仍然是使用大肠杆菌 进行异种基因表达最大的障碍。
通过改变细胞的折叠机制提高产品质量
1. 如果我们设计生产的蛋白在一种热力学不稳定的状 态，我们则无法获得这种可溶性蛋白。
2. 细胞会使用分子伴侣（阻止聚集作用的路径）和可 折叠的催化剂（促进可折叠过程的特殊阶段）来制 造一个合适的折叠蛋白分子。
由于转录水平调控的研究已比较清楚，因此，目 前基因表达经常遇到的问题关键是翻译水平的调控， 一般决定翻译水平的范围包括起始密码AUG及其其上 下游的序列。为提高翻译效率，人们在设计表达载体 时采用了许多办法，并将新发现应用到表达载体构建 上。
（2）融合表达载体
其忧点是：①由于翻译起始信号在调控翻译强 度中是最重要的，融合表达载体通常SD-AUG已臣 定，翻译起始信号组织合理．利于翻译起始；② 简化蛋白分离纯化工艺；③将分子量较小的蛋白 质以融合蛋白形式表达．可增强mRNA及表达产物 的稳定性④有些蛋白质通过融合表达产生可溶性 蛋白。
（4）带纯化标签的表达载体
出于纯化的目的，人们设计了一些用于 纯化目的蛋白的tag，称为纯化标签，用于表 达载体的构建。目前用的较多的纯化标签是 GST-tag、 FLAGl-tag和His-tag。
（5）带伴侣蛋白的表达载体
伴侣蛋白(chaperone)是一类非常保守的蛋 白质，它的主要作用是使目的蛋自在未折叠或部 分折叠状态下保持暂时稳定，从而形成正确折叠。 伴侣蛋白主要是热休克蛋白类。大肠杆菌中存在 的伴侣蛋白有4种：GrcEL、Gres、Dnak、HtpG 。
•Translational fusions (例如lacZ)最早用于获得大肠杆菌中高 水平表达。
•这些融合有限制基因不可靠产物的效用。
•翻译融合技术已经演化到可以在大肠杆菌中生产高水平的融 合基因产品。通过使用特殊蛋白酶移除融合伴侣，很快可以被 转化成非融合的可靠蛋白。同时辅助了溶解性的增加，可以为 一步法重组蛋白提纯提供一个通用的“操作杆”。
正因为伴侣蛋白具有促进蛋白质正确折叠的 能力，因此，人们试图通过与伴侣蛋白的共表达 来避免包涵体的产生．
（6）表面呈现表达载体
表面呈现表达分两种情况：一种是噬菌体表面呈 现技术．另一种是细菌表面呈现。
此处仅讨论后一种。细菌表面呈现表达优越性在 于：可以提供活疫苗及有利于寻找药物；有助于研
3. 分泌过程也会与蛋白折叠相配合。
4. 我们所得到的大多数关于E. coli蛋白折叠机制同样 适用于Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）的异源基 因表达。
异源基因产物优化标准
Foster提出了异源基因产物优化标准（即从细胞 中回收蛋白的标准）
优化细胞分裂方法
目前成功的融合表达系统主要有以下几种：① GST (glutathione S-transferase)系统 ；②β--半乳 糖苷酶系统 ；③麦芽糖结合蛋白(MBP)系统 ；④ 蛋白A系统 ；⑤纯化标签融合 等
（3）分泌表达载体
由于蛋白在表达过程中常形成包涵体， 克服此类问题的主要方式是以分泌表达形式， 将蛋白运送到外周质、外膜甚至进入培养介 质中，这需要在信号肽的帮助下完成。
减低目的基因产物的产量导致不可靠地截断产物 的生成。 密码子遗传背景影响的位置敏感性在3’端的遗传 信息比在5 ’末端更严重。 通过改变较大肠杆菌或为大肠杆菌宿主解码稀有 碱基的供体tRNA偏爱密码子稀有使用的密码子容 易补救二者之一。
大肠杆菌基因融合中基因优化的long-accepted途径