动物检验检疫学 实验一 动物病原细菌的分离与鉴定

实验一动物病原细菌的分离与鉴定

一、实验目的

了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法

二、实验原理

初步分离鉴定：利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性，观察细菌培养特征；

确定细菌的血清型、毒力因子：血清学检测或PCR检测技术

大肠杆菌的培养特征：37℃,培养24h,各种培养基生长特征：

普通营养琼脂平板：白色圆形，隆起，中等大小

麦康凯琼脂：红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小

糖铁琼脂斜面培养基：底层变黄，产酸产气

伊红美蓝培养基：黑色、金属光泽

革兰氏染色：革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌

血清学鉴定：玻片凝集实验：颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。大肠杆菌中，为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐热性高于K抗原，实验前进行、高压或煮沸处理。

三、实验材料

1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠

2）菌株：致病性大肠杆菌菌株

3）试剂：营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。

4）仪器：显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。

四、操作步骤

1.分离培养

第一天：

1.）处死小鼠，无菌解剖

2.）观察各脏器是否出现肉眼病理变化；

3.）无菌采集内脏病料，通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯（CT-MAC)琼脂平板各一块，37℃培养24h；

4.）同时无菌挑取一小块病料，直接涂片，吉姆萨染色，油镜观察组织中的细菌特征；

第二天

5.）挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤，37℃培养24h。挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。

糖（醇）类发酵实验：接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基，麦芽糖发酵培养基，一支接种，一支对照；接好后置于37℃温箱中培养24h。

吲哚（Indol）试验：接种到胰蛋白胨水（含色氨酸）培养基中，37℃培养24-48h。

甲基红（Methyl red)试验：将菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。

VP(PVoges-Proskauer)试验：将菌种接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。

硫化氢试验：将菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37℃培养24h。

柠檬酸盐试验（Citrate utilization）：取少量菌种接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h。

第三天

１.观察现象，滴定检验

吲哚（Indol）试验：沿管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。

甲基红（Methyl red)试验：加甲基红指示剂数滴，观察。

VP(PVoges-Proskauer)试验：加ＶＰＡ液６滴，Ｂ液２滴，用力振荡，观察现象

２.进一步进行血清学检测，采用玻片凝集试验

Ｏ血清型鉴定：

将生化特征符合大肠杆菌的营养肉汤培养液，置于１２１℃高压２ｈ制高压抗原；；然后用大肠杆菌Ｏ抗原单因子血清进行玻板凝集试验，鉴定分离株的Ｏ血清型。

拨片凝集实验：

取洁净载玻片一张，用微量加样器分别取２５ｕｌＯ单因子血清加至载玻片内，再用微量加样器加２５ｕｌ待鉴定的细菌，将他们充分混匀，将载玻片轻轻摇动１～２分钟，观察结果并记录报告。

五、实验结果

1.解剖及制片观察结果

解剖后观察小鼠腹部，发现内部脏器没有较大的病理变化，但纵切开小肠剥去小肠内容物，可见血丝分布在肠壁上。

制片观察：我们组的片子只看到被染成淡紫色的组织细胞和深紫色的肠内内容物，内容物有的为团状。但在任何视野中都没有找到细菌。

借来观察成功的片子来看，可见清晰的组织与细菌，背景为淡紫色的小肠组织，细菌被染成深紫色，呈长杆状，还有螺线状，球状三种形态。猜测为大肠杆菌。

普通培养基培养结果：培养基中长满了隆起、白色的菌落，菌落与大肠杆菌的相似。

改良山梨醇麦康凯培养基:整个培养基是一片红色，未看到生长出来的菌落。

伊红美蓝培养基：有绿色金属光泽菌落。

TSI:斜面处培养基为黄色瓶底处培养基为深红色，表明产酸产气。

糖发酵结果：乳糖发酵管：由紫色变为深红色

蔗糖发酵管：有浅蓝色变为浅黄色

麦芽糖发酵管：由蓝色变为深黄色

甘露糖发酵管：由蓝色变为深黄色

葡萄糖发酵管：由蓝色变为深黄色

生化鉴定结果：吲哚实验：滴加吲哚试剂后，液面出现红色，阳性

甲基红试验：加甲基红后，变为红色，阳性

Korser氏肉汤：无明显变化，依然澄清透明，即如果为阴性

蛋白胨水培养基：滴加指示剂后，出现红色，结果为阳性，硫化氢鉴定为阴性

玻片凝集实验:未出现凝集现象

六、讨论分析

蛋白胨水培养基应为阴性，而实验如果却为阳性；拨片凝集实验结果应为阳性，而实验结果

却为阴性，除此之外，其他均符合大肠杆菌的特性，故可推测两个不符合大肠杆菌特点的是由于菌太稀的原因，基本断定为大肠杆菌，但建议用PCR的方法进行再次鉴定。

七、思考题

1.通过本次试验是否可以确定引致小鼠死亡的病原菌？

答：不能。因为本次试验结果并没有肯定的结果，而且之前虽然的ＣＴ－ＳＭＡＣ培养基长出了大肠杆菌的典型菌落，但是不排除存在其他菌的可能性，及并不能确定大肠杆菌即是致命菌。

2.暴发性传染病，如何鉴定病原微生物？

答：遵循柯赫原则，

Ａ．取病料，培养，分离，纯化细菌

Ｂ．生化鉴定，抗原表型及ＰＣＲ鉴定

Ｃ．将纯化的细菌回归到易感动物，观察是否死亡。

Ｄ．分离，纯化动物的病菌，并鉴定。

若仍是注射的菌即为病原微生物