高效毛细管电泳
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负面作用 • 减少分离时间和分离有效距离 • 电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性
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Lazard 11-06
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电渗流的影响因素-1.pH值
16
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16
电渗流的影响因素-2.温度
温度升高，电渗流降低； 温度变化1%，迁移时间变化2-3%； 液体制冷：更高的电压、更高的离子强度和更大内径的毛细管；
高效毛细管电泳
Capillary Electrophoresis (CE)
生物基础实验中心生物化学分室 2010年10月
1
Lazard 11-06
1
毛细管电泳的组成部分
毛细管 入口
电极
获取数据
检测器 电解质缓冲液 电解质缓冲液
毛细管 出口
电极
缓冲瓶
缓冲瓶
高压电源
2
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2
毛细管电泳仪的基本结构
22
Lazard 11-06
22
检测器
UV: 蛋白/DNA， PI，纯度，相互作用 200, 214, 254, 280 nm 涂层毛细管需用UV
23
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23
检测器
PDA: 蛋白分子量SDS-Mw，有波长校正功能
UV
PDA
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小分子检测
1. 有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器
18
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毛细管的预处理
• 外壁：聚酰亚胺涂层
• 窗口的制做：3-5 mm 非涂层：烧制，酸腐蚀，刀刮 涂 层：浓硫酸，加热
• 活化/预处理： 非涂层：甲醇，NaOH，水，缓冲液 涂 层：HCl，水，缓冲液
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进样方法的选择
(1) 压力进样 0.1-25 psi (2) 电动进样 1-10 kV (3) 重力进样
One Instrument
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第一章 毛细管区带电泳 (CZE)
8
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毛细管区带电泳 (CZE)
• 无凝胶，无表面活性剂 • 最基本最常用，分辨率高，操作简单
• 离子 化合物 蛋白纯度 构型确认分析
……
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什么是电泳Electrophoresis?
21
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21
CE检测器种类及性能
• 检测系统
HPCE的种类及性能
检测方式 紫外-可见光吸收
质量检测限(mol) 10-13～10-16
浓度检测限(M)* 10-5～10-8
荧光
10-15～10-17
10-7～10-9
激光诱导荧光
10-18～10-20
10-14～10-16
安培 电导 质谱
25
大分子检测
1. 蛋白、核酸 - 可以首先选择紫外检测器 - 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方 法标记荧光，然后用LIF检测 - 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后 再LIF检测 - 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测
anode
cathode
带电的分子在电场的作用下发生移动
10
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10
电压、电流、功率
贝克曼毛细管电泳：
电 压： 0 — 30 kV (300-500 V/cm) 电 流： 0 — 300 uA (< 150 uA) 功 率： 0 — 9 W
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毛细管电泳分离过程
2. 无紫外吸收 - 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测 器检测，如氨基酸、还原性糖等 - 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检 测，也可以尝试电化学检测器
3. 有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器 4. 需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑
质谱检测
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定量分析更准确
CGE 选择性进样
如何提高进样准确度？
20
样品的富集
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20
CZE分离条件的选择
• 毛细管类型--涂层还是非涂层？ • 毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？ • 毛细管内径--粗毛细管还是细毛细管？ • 缓冲液体系--种类和pH值 • 添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈 • 检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光
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电渗流(Electroosmotic Flow, EOF)
V Q/M
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表观速度 = 电渗流速度 + 电泳速度
电渗流
纯电泳
电渗流 + 电泳
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电渗流的正面及负面作用
正面作用 • 增加分离速度 • 使得正、负电荷物质同时分离
离子(Ǻ)→小分子→大分子→病毒→细胞(um) • 经济-Low Cost 试剂消耗可用分（￥）来计算 • 环保-Green 水相分离体系，对人和环境无危害
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高分离效率
6
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毛细管电泳－灵活多样的模式选择
• 毛细管区带电泳（CZE） • 毛细管凝胶电泳（CGE） • 毛细管等电聚焦（CIEF） • 毛细管胶束电动色谱（MEKC） • 亲和毛细管电泳（ACE） • 非水相毛细管电泳（NACE） • 毛细管电色谱（CEC）
250 200
150 100
50 0 0
No Cooling Forced Air
Liquid
5 10 15 20 25 30
VOLTAGE (kV)
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电渗流的影响因素
3.毛细管壁的吸附 出峰时间不断拖后？ 涂层毛细管
4.离子强度 离子强度越高，电渗流越小
5.缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精
3
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4
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4
毛细管电泳的特点
• 高分离效率-High Performance 毛细管电泳：超高分辨率分离时代的来临（Science 2002,1441）
• 快速-High Speed Seconds~Minutes • 分析范围广-Comprehensive
10-18～10-19 10-15～10-16 10-16～10-17
10-10～10-11 10-7～10-8 10-8～10-9
*假定进样体积为 10nl
优缺点
接 近 通 用 型 ， Biblioteka BaiduAD 可给出光谱信息 灵敏度高，样品常需 衍生化
极端灵敏，样品常需 衍生化
选择性好，用专门装 置测电活性组分 通用型，需用专门装 置和毛细管处理 灵敏，可给出结构信 息，接口复杂
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电渗流的影响因素-1.pH值
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电渗流的影响因素-2.温度
温度升高，电渗流降低； 温度变化1%，迁移时间变化2-3%； 液体制冷：更高的电压、更高的离子强度和更大内径的毛细管；
高效毛细管电泳
Capillary Electrophoresis (CE)
生物基础实验中心生物化学分室 2010年10月
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毛细管电泳的组成部分
毛细管 入口
电极
获取数据
检测器 电解质缓冲液 电解质缓冲液
毛细管 出口
电极
缓冲瓶
缓冲瓶
高压电源
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毛细管电泳仪的基本结构
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检测器
UV: 蛋白/DNA， PI，纯度，相互作用 200, 214, 254, 280 nm 涂层毛细管需用UV
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检测器
PDA: 蛋白分子量SDS-Mw，有波长校正功能
UV
PDA
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小分子检测
1. 有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器
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毛细管的预处理
• 外壁：聚酰亚胺涂层
• 窗口的制做：3-5 mm 非涂层：烧制，酸腐蚀，刀刮 涂 层：浓硫酸，加热
• 活化/预处理： 非涂层：甲醇，NaOH，水，缓冲液 涂 层：HCl，水，缓冲液
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进样方法的选择
(1) 压力进样 0.1-25 psi (2) 电动进样 1-10 kV (3) 重力进样
One Instrument
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第一章 毛细管区带电泳 (CZE)
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毛细管区带电泳 (CZE)
• 无凝胶，无表面活性剂 • 最基本最常用，分辨率高，操作简单
• 离子 化合物 蛋白纯度 构型确认分析
……
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什么是电泳Electrophoresis?
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CE检测器种类及性能
• 检测系统
HPCE的种类及性能
检测方式 紫外-可见光吸收
质量检测限(mol) 10-13～10-16
浓度检测限(M)* 10-5～10-8
荧光
10-15～10-17
10-7～10-9
激光诱导荧光
10-18～10-20
10-14～10-16
安培 电导 质谱
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大分子检测
1. 蛋白、核酸 - 可以首先选择紫外检测器 - 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方 法标记荧光，然后用LIF检测 - 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后 再LIF检测 - 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测
anode
cathode
带电的分子在电场的作用下发生移动
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电压、电流、功率
贝克曼毛细管电泳：
电 压： 0 — 30 kV (300-500 V/cm) 电 流： 0 — 300 uA (< 150 uA) 功 率： 0 — 9 W
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毛细管电泳分离过程
2. 无紫外吸收 - 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测 器检测，如氨基酸、还原性糖等 - 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检 测，也可以尝试电化学检测器
3. 有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器 4. 需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑
质谱检测
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定量分析更准确
CGE 选择性进样
如何提高进样准确度？
20
样品的富集
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CZE分离条件的选择
• 毛细管类型--涂层还是非涂层？ • 毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？ • 毛细管内径--粗毛细管还是细毛细管？ • 缓冲液体系--种类和pH值 • 添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈 • 检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光
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电渗流(Electroosmotic Flow, EOF)
V Q/M
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表观速度 = 电渗流速度 + 电泳速度
电渗流
纯电泳
电渗流 + 电泳
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电渗流的正面及负面作用
正面作用 • 增加分离速度 • 使得正、负电荷物质同时分离
离子(Ǻ)→小分子→大分子→病毒→细胞(um) • 经济-Low Cost 试剂消耗可用分（￥）来计算 • 环保-Green 水相分离体系，对人和环境无危害
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高分离效率
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毛细管电泳－灵活多样的模式选择
• 毛细管区带电泳（CZE） • 毛细管凝胶电泳（CGE） • 毛细管等电聚焦（CIEF） • 毛细管胶束电动色谱（MEKC） • 亲和毛细管电泳（ACE） • 非水相毛细管电泳（NACE） • 毛细管电色谱（CEC）
250 200
150 100
50 0 0
No Cooling Forced Air
Liquid
5 10 15 20 25 30
VOLTAGE (kV)
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电渗流的影响因素
3.毛细管壁的吸附 出峰时间不断拖后？ 涂层毛细管
4.离子强度 离子强度越高，电渗流越小
5.缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精
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毛细管电泳的特点
• 高分离效率-High Performance 毛细管电泳：超高分辨率分离时代的来临（Science 2002,1441）
• 快速-High Speed Seconds~Minutes • 分析范围广-Comprehensive
10-18～10-19 10-15～10-16 10-16～10-17
10-10～10-11 10-7～10-8 10-8～10-9
*假定进样体积为 10nl
优缺点
接 近 通 用 型 ， Biblioteka BaiduAD 可给出光谱信息 灵敏度高，样品常需 衍生化
极端灵敏，样品常需 衍生化
选择性好，用专门装 置测电活性组分 通用型，需用专门装 置和毛细管处理 灵敏，可给出结构信 息，接口复杂