代谢物酶法分析技术 ppt课件

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底物循环－脱氢酶－辅酶系统
用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和NADH)。
用395 nm ～415 nm 波长测定反应中氧化型thioNAD+ 转为还原型thio-NADH的增加速度。 循环反应条件： 酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力。 溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。 thio-NAD+ 和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。
碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以
计算出标本中有机磷的含量。 另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。
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代谢物酶法分析的设计要求
试剂酶概念 试剂酶质 量 试剂酶特征 试剂酶来源 试剂酶纯度 酶法设计共性要求 平衡法设计的要求 速率法设计的要求
酶法设计要求
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氨循环－合成酶－脱氢酶系统
NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转 化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和
NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成
NADH，在340nm测定。
ATP NAD合成酶 AMP+PPi NH4+ + 脱氨-NAD
Mg2+
NAD+ 亮氨酸
胆绿素+ H2O 胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在
450nm处测定吸光度下降
胆红素 + O2
BOD
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双底物反应直接测定法
对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设 计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大， 即[S2] >> Km2，这时的酶促反应动力学可按单底
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(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
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(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
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平衡法与速率法的相互联系
平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反 应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会 达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平
衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使
酶促反应成一级反应。
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底物循环－脱氢酶－辅酶系统
血淸胆汁酸测定
Thio-NAD+
3α -HSD
Thio-NADH(黄色) 循环
3α -HSD
胆汁酸 NAD+
3-酮类固醇 NADH
胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代
还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测 物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。
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平衡法（终点法） 代谢物酶法分析 速率法（动力学法）
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(1)
平衡法基本理论
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐 渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示 反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称 为终点法(end-point method)。

平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、
微量元素或辅酶的含量。
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酶活性恢复 法
异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 异柠檬酸+ NADP+

α-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+
ICDMg
用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离 子，标本中Mg2+通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的 正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸 光度的増加。
第五章
代谢物酶法分析技术
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代谢物酶法分析技术的概念
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶
促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利
用酶促反应测定酶活性的一类方法。
代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测
定人体內的代谢物或代谢产物的技术。
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代谢物酶法分析的理论基础
P-6-GA + NADPH + H+

G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
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脱氢酶指示系统
血清尿素测定 2NH3 + 尿素 + 尿素酶 H2O CO2 NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应
动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中， 因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。
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双底物反应直接测定法
乳酸测 定 LD 乳酸 + 丙酮酸 + NADH + NAD+ H+ 在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法
亮氨酸脱氢酶
NH4+ + 氧化异己酸 NADH
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酶循环法具有的特点
灵敏度随反应时间的延长而提高 灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高 利用酶对底物的特异性,使测定系统简化 利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定
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(4)
其他酶法
酶活性恢复法
很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才 发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元 素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶 与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
代谢物酶法分析的方法
代谢物酶法分析主要优 点 酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理 就能测定，简化了实验程序；
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品
对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线 性测定范围等方面都优于传统的化学法

谷氨酸 + H2O + NAD+
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
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脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆
汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以
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(1)
单酶反应直接法
待测物与产物在理化性质上有便于检测的信 号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产 物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为
直接法。
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单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测 定 UAO 尿酸 + O2 + 尿囊素 + CO2 + HO H2O 2 尿酸在2932 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
甘油浓度测定
ATP 甘油
GK
ADP
NAD+
G-3-PDH GPO
NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 H2O2
甘油-3-磷酸 O2
通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复
循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环 不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计 的量决定于t 和每min循环次数。
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产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一 种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生
物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。
检测指示系统： ①循环前、后用速率法测定 NADH(340 nm) 的变化。②检测产物H2O2可通
过Trinder 反应比色测定。
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表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、
产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶 血等色素干扰。
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(3)
酶循环法
利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促
反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应
产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质
的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定 于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两 种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的 Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。

丙酮酸测定 乳酸 + NAD+ 在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法 丙酮酸 + NADH + H+

LD
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(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
A B C
(1)
试剂酶的质量要求
试剂酶的概 念 试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度
或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的 质量是酶试剂质量的决定性因素。
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(1)
试剂酶的质量要求
试剂酶的来源和理化特 征 主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。
基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量
少且价格低廉。
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
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脱氢酶指示系统
血清葡萄糖己糖激酶法测定
Glu + ATP
G-6-P + NADP+
G-6-P+ADP
不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。 必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最 适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂 和抑制剂对酶活性的影响。
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(1)
试剂酶的质量要求
试剂酶的纯度要 求 不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要
求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较
高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。
胆固醇酯 + H2O 胆固醇 + 脂肪酸
△4-胆甾烯酮 + H2 O 2 H2O2 + 4-AAP + 红色醌类化合 酚 物 指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定 胆固醇 + O2
COD
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过氧化物酶指示系统
常用的Trinder反应生色基团 化学名 酚 2，4-二氯酚 N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺 N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺 N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺 英文缩写 P 2，4-DCP EMAE TOOS ESPDMA 最大吸收峰 （nm） 500 510 555 555 585
纯度主要指标 ①酶的比活性，酶的比活性越高，
酶的纯度越高。②杂酶含量，容易引起副反应的一
些酶含量按 “允许限度”的要求（见表5-2）。
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表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求
名称 来源 分子量 等电 点 4.30 比活性 杂酶占试剂酶活性的 (U/mg) %（允许限度） ＞20
蔗糖酶含量＜0.01%,过 氧化氢酶＜10U/mg蛋白
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酶活性恢复法应用举例
丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子 α-半乳糖苷酶法测定钠离子
淀粉酶法测定氯离子
超氧化物歧化酶法测定铜离子
碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等
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激活和抑制法
根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动
力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。
有机磷的酶法测 定 有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆 碱酯酶与标本在37℃水浴10min，测定剩余的乙酰胆
及
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指 示
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过氧化物酶指示系统
共用的指示反应 最早由Trinder氏 等人提出，被称 为Trinder反应
最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。
已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油 三酯等项目的测定
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过氧化物酶指示系统
血清总胆固醇氧化酶测定法
Ea Ei
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
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脱氢酶指示系统
氧化型辅酶 NAD(P)+ 在340 nm 处没有 吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
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脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
186000 葡萄糖氧化 A.niger 酶（GOD） p.notatum 152000 己糖激酶 (HK) 葡萄糖-6磷酸脱氢酶 (G-6-PDH) 过氧化物酶 (POD) 酵母 105000