基因图位克隆的策略与途径

基因图位克隆的策略与途径

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。

基因(gene)是遗传物质的最差不多单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研

究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。

1、图位克隆

Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.

用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了（图1）。

目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时刻。在那个过程中，我们从选择突变体开始，逐步找到和表型有关的基因。这和反向遗传学（reverse genetics）的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序打算的完成和各种分子标记的发觉。这些数据被储存在专门的数据库中（表1）（Lukowitz等，2000）。

表1 拟南芥网络资源

网站网址

Supplemental material for this paper /methods/ppsuppl.html

Nottingham Stock Centre（U.K.）/

Recombinant Inbred map /new_ri_map.html

Ohio Stock Center（U.S.A.）/aims/

TAIR database*，homepage

Recombinant Inbred map（mirror site）

CAPS markers

Sequence table

SNP collection

CEREON collection of polymorphisms

SSLP markers /SSLP_info/SSLP.html

TIGR，genome annotations

Database of Ler sequences

Kasuza DNA Research Institute，genome

annotations

MIPS genome annotations http://websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/

SINS database of transposon insertions

在拟南芥中的图位克隆，在专门大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。实现基因图位克隆的关键是选择与目标基因连锁的分子标记。实质上，分子标记是一个特异的DN A片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的选择（Wang等，2000）。其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNP s）。

SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测专门直截了当，然而我们需要设计引物来检测假定的SSLP标记；对SNPs标记的检测也比较直截了当，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差不，这些差不的核苷酸通常位于非编码区域（Peters等，2003）。最常见的用于检测SNPs标记的方法要紧是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam等，1989；Michaels 和Amasino，19 98）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。

图位克隆法随着有关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表2）。

表2 用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因