猪丹毒杆菌的检验

器材：1ml注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。
四、操作步骤
四、动物实验 2.实验步骤 每组取2只小鼠，以每只0.2mL剂量进行一次性腹腔注射1 只，另一只注射0.2mL无菌生理盐水，观察，分别记录 小鼠死亡状况。
四、操作步骤
四、动物实验 3.病理解剖和细菌分离 病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏， 触于血清平板， 37℃培养12~18h。记录结果。
血清琼脂：菌落特 征：细小、圆形、 透明、凸起、灰白 色、有光泽、质软、 露珠样、易混悬于 盐水中。
血液琼脂：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血 环（α溶血）
TSB肉汤：轻度 混浊，振动试管 呈现出云雾状， 类似试管刷，有 少量灰白色粘稠 沉淀，不形成菌 膜和菌环。
革兰氏染色，显微镜观察：分离菌均为革兰氏阳性杆菌，菌 体细长、长短不一，有时呈长丝形，单独存在，有时呈短 链或V形排列。
四、操作步骤
（三）生化实验


将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20℃培养7天，逐日 观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与 冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳 性。 V-P试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。
四、操作步骤
（三）生化实验
项目
葡萄糖 乳糖
结果
﹢ ﹢
项目
再于沸水浴中10 min，随后立即在冰中冷却，然后在
12000 r/min及4℃条件下离心5 min，取上清液为猪丹毒 杆菌基因组DNA模板。
（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
猪丹毒杆菌的检测步骤
5、电泳检测：取5μL PCR产物直接经1%琼脂凝胶（含 0.5μg/mL溴化乙锭 ）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。
实验六 猪丹毒杆菌检验
一、实验目的

1、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；

2、了解检验猪丹毒杆菌的意义。
二、实验说明
猪丹毒(Swine erysipelas)是由猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一种人畜共患传染病，其主要特征 为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及 皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。 猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体 丹毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种， 对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现la, 1b, 2-24 和N型共26个血清型，大约80%以上的猪源性分离株属1 型(la和1b)和2型，我国优势血清型也为1a, 1b和2型。
（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
M 1 2 3 4
2000 1000 750 500 250 100
937bp
猪丹毒杆菌PCR检测结果电泳图
说明：M—DL2000；1—阳性对照；2、3——被检样品；4—阴性对照。
四、操作步骤
四、动物实验 1.实验材料 实验动物：雌性昆明小鼠，体重18~22g
枸盐酸盐 靛基质
结果
-
果糖
蔗糖 山梨醇 鼠李糖 M.R.(甲基红 )
﹢
-
硫化氢
甘露醇 七叶苷 木糖 V-P
﹢
-
氧化酶
硝酸盐还原
-
过氧化氢酶
明胶
不液化
注：＋表示阳性; －表示阴性。
（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reactioຫໍສະໝຸດ Baidu ，PCR）
猪丹毒杆菌的检测步骤 1、引物： P1：5'-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3' P2：5‘-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3'
猪丹毒杆菌的检测步骤 4、DNA的提取： 将被检菌株接种于3 mL TSB肉汤中， 37℃振荡培养(150 r/min) 10~12h后，取1 mL培养液于 1.5 mL离心管中，经12000 r/min 4℃离心5 min，弃去上 清液，用200μL ddH2O或者TE缓冲液(pH8.0)重悬沉淀，
（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
猪丹毒杆菌的检测步骤 3、反应条件： 95℃，5min 95℃，1min 63℃，1min 72℃，1min 72℃，10min
40次循环
（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
四、操作步骤
（三）生化实验

自TSA琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接 种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。 以无菌操作将各菌分别穿刺接种至SIM培养基中，将所有 试管置于37℃下培养24-48小时。
如试管5：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢 （变黑）。
生化反应
PCR鉴定
猪丹毒杆菌 血清型鉴定 结果报告
四、操作步骤
（一）增菌 以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样 品转至营养肉汤中，于36℃士1℃培养8 h~10h。 （二）分离和培养 对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼 脂培养基上，37℃培养24～48h。或经TSB肉汤37℃培养 24h后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，37℃培 养24h。
（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
猪丹毒杆菌的检测步骤 2、反应体系 反应总体积为25 μL ，其中含有12.5 μL的PCR Master Mix， 10 μmol/L上、下游引物各1 μL, 1 μg/L DNA模板5 μL ，灭菌双蒸水6.5 μL 。
类丹毒
不规则鲜红色斑块
“大红袍”
心瓣膜增生 ：疵状心内膜炎的病变， 二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物
大紫肾 ：典型的败血脾;肾淤 血、肿大
脾充血肿大
三、检验程序
显微镜检查
直接涂片 革兰氏染色 镜检 血液或血清 琼脂平板 选取可疑菌 落涂片镜检、 纯培养
检样
分离培养
动物试验
马丁肉汤 临症表现 病理变化 染色镜检 分离培养
（六）结果与报告 综合以上生化试验、PCR鉴定和动物实验的结果，报告样品中 检出或未检出猪丹毒杆菌。