中药单体姜黄素超分子抗肿瘤复合物的筛选及评价

中药单体姜黄素超分子抗肿瘤复合物的筛选及评价

姜黄（Curcuma longa L.）、郁金（Curcuma rcenyujin Y,H.Chenet C.Ling）和莪术（Curcuma zedoaria（Christm.）Rosc.）均为姜科植物。中医认为姜黄能行气、散风活血、通经止痛;郁金能活血止痛、行气解郁、清心凉血、利胆退黄;莪术具有行气解郁、破瘀、止痛的功效。

三者的药理活性集中表现为抗肿瘤、抗真菌、抗炎、降血脂、利胆、保肝和抗血栓形成等。姜黄素是从姜科植物姜黄、郁金、莪术根茎中提取得到的一种植物多酚,研究表明,其具有抗肿瘤、降血脂、抗溃疡、抗炎、抗菌、利胆等药理作用。可见,姜黄素是姜黄、郁金、莪术中发挥药理作用最重要的药物活性成分（Active pharmaceutical ingredients,API）,其最显著的优势是无明显的毒副作用。尽管姜黄素对人的安全剂量高达12 g/天,但是姜黄素极低的水溶性和生物利用度

使其应用受到限制。

药物共晶和共无定形是API与生物相容性小分子前体（Co-amorphous

former,CAF;Co-crystal former,CCF）（而非高分子聚合物）以氢键、范德华力等非共价作用力结合而成的超分子体系,其不改变API分子本身的化学结构,使

其保持原有药理活性,但能改善API的溶解度、溶出速率、生物利用度等性质,

故在改善API理化性质的研究领域备受关注。本论文以中药单体姜黄素为模型分子筛选共晶等超分子复合物,以其抗肿瘤作用为目标,探索姜黄素与CCF之间不

同作用方式对其性质的影响,包括溶解度、溶出速率、与BSA的结合规律、体内药代动力学、体外细胞毒性。

该研究将现代晶体工程学的方法和理论应用到对传统中药有效单体成分的．

不良理化性质改善的研究中,为将姜黄素共晶等超分子开发为具有明确抗肿瘤机制的复合物体系奠定理论基础。第一部分基于姜黄素的超分子复合物的筛选及理化性质评价目的:以姜黄素为模型API,筛选基于姜黄素的共晶或共无定形超分

子复合物,改善姜黄素的溶解度、溶出速率等理化性质。

方法:以姜黄素为API,以小分子有机酸、氨基酸、酰胺类和哌嗪类等化合物以及具有药理活性的其它API（Ⅱ）为CCF,采用溶剂辅助研磨法筛选共晶或共无定形超分子;应用X-射线粉末衍射（Powder x-ray diffraction,PXRD）、差示扫描量热（Differential scanning calorimeter,DSC）、热重（Thermogravimetric analysis,TGA）、场发射扫描电镜（Field emission scanning electron microcopy,FESEM）、红外光谱（Infrared radiation,IR）、固态核磁（Solid state nuclear magnetic resonance,ssNMR）等技术对超分子复合物进行表征;并分别采用饱和溶解度法和桨法测定复合物的溶解度和体外溶出速率。结果:联合PXRD 和DSC分析,确定筛选出API-CAF共无定形一个:姜黄素-哌嗪共无定形;API-CCF 共晶两个:姜黄素-哌嗪和姜黄素-异烟碱共晶;API（I）-API（Ⅱ）共晶一个:姜黄素-没食子酸共晶。

IR和ssNMR分析结果表明,姜黄素-哌嗪和姜黄素-异烟碱共晶超分子复合物中的氢键类型为C=O???H-N,其中C=O来源于姜黄素,N-H来源于哌嗪和异烟碱;而姜黄素-没食子酸共晶中则存在源于姜黄素的酚O-H和没食子酸C=O的C=O???H-O氢键。体外溶出结果表明,共晶的溶出速率与姜黄素单体相比有较大提高

（P<0.05）。

结论:姜黄素共晶复合物能有效的改善其体外的溶解度、溶出速率,姜黄素共第二部分荧光光晶超分子复合物的筛选在提高其体外理化性质方面有较大潜力。．

谱法和DFT理论计算研究姜黄素超分子复合物与牛血清白蛋白的相互作用目的:在生理p H条件下,对姜黄素单体及其共晶超分子复合物与牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）的作用机制进行研究,从分子水平探索姜黄素形成共晶超分子后与姜黄素单体相比,其与BSA的结合规律发生的变化及原因,为深入研究基

于姜黄素的超分子复合物在体内的储存、运输、作用机理提供参考。

方法:采用荧光光谱技术,辅助紫外光谱和密度泛函理论（Density

functional theory,DFT）模拟计算,研究人体生理pH条件下姜黄素与BSA和姜黄素-CCF超分子复合物与BSA的相互作用,通过绘制298、310和315 K温度下Stern-Volmer和修正的Stern-Volmer曲线并进行相关计算,确定各自的荧光猝

灭机理,测定结合常数、结合位点数及热力学参数。结果:姜黄素、姜黄素-哌嗪和姜黄素-异烟碱共晶随着温度的升高,其与BSA的结合常数K_b减小,说明猝灭过程为静态猝灭;而姜黄素-没食子酸共晶的K_b值随温度

的升高逐渐增大,但其猝灭常数随温度的升高呈降低趋势,推测猝灭过程为动态

猝灭伴随静态猝灭;热力学函数的计算表明,姜黄素、姜黄素-哌嗪和姜黄素-异烟碱共晶与BSA结合依靠氢键和/或范德华力,而姜黄素-没食子酸与BSA的结合过程中,疏水作用力起主要作用;通过比较姜黄素及其复合物与BSA的

K_b可知,CCF的引入影响了姜黄素与BSA的结合。

DFT计算结果显示,与色氨酸-（姜黄素）相比,色氨酸-（姜黄素-哌嗪）复合物

中氢键变得更弱,姜黄素-哌嗪超分子与BSA结合能(-17.9

kJ·mol^-1)比姜黄素(-26.1 kJ·mol^-1)弱,此结果与荧光光谱实验结果一致。结论:基于姜黄素的API-CCF超分子的形成可能改变姜黄对结合,不同,CCF从而对其体内的运输产生影响,的结合机制及结合力BSA素与

的程度和方式均有影响。

此研究从分子水平上模拟药物共晶在体内的运输过程,对于阐明药物共晶的作用机制、药代动力学以及生物大分子与药物小分子的相互作用的化学本质具有重要意义。第三部分姜黄素及其复合物体外细胞毒性评价及UPLC-MS/MS法测定大鼠体内药代动力学目的:建立姜黄素及其复合物的体内浓度的UPLC-MS/MS测定方法,对姜黄素及其复合物的体内药代动力学进行评价;以其抗肿瘤活性为研究对象,评价超分子复合物的抗肿瘤特性,从而建立基于姜黄素超分子复合物的抗肿

瘤模型。

方法:采用UPLC-MS/MS法测定血浆中姜黄素的浓度,对姜黄素和共晶复合物进行大鼠体内药代动力学研究。通过MTT法,对姜黄素及其复合物作用于人结肠癌细胞（HT-29）、肺癌细胞（A549）和肝癌细胞（Hepg）的细胞毒性进行评价。

结果:与姜黄素单体相比,共晶复合物的药代动力学参数C_max、

T_max、AUC_0-t以及AUC_0-∞均有显著性改

善（P<0.05）,其中C_max增加约30倍,T_max缩短约6倍,生物利用度提高超过6倍。姜黄素与没食子酸形成共晶后,共晶中没食子酸的药代动力学参数C_max、T_max、AUC_0-t以及AUC_0-∞与没食子酸单体相比有所降低,但结果没有统计性差异。

由MTT实验结果表明,姜黄素-哌嗪和姜黄素-异烟碱共晶对HT-29、A549和Hepg 细胞的抑制率均大于姜黄素,但结果没有统计性差异。姜黄素-没食子酸共晶对

A549细胞的抑制率在高浓度时呈现高于姜黄素的趋势（结果无显著性差异）,而