瘤胃微生物研究进展

瘤胃微生物与瘤胃发酵调控研究进展
一、国内研究进展
1.植物提取物对瘤胃发酵调控的影响
陆燕等(2009)综述了大蒜素及其抑菌机制，以及大蒜素对甲烷产量和瘤胃发酵的影响。

认为大蒜中活性物质能调控瘤胃发酵模式，可抑制瘤胃内甲烷生成，降低蛋白降解率，降低氨态氮浓度，保护过瘤胃蛋白。

与其他植物提取物相比，添加低浓度的大蒜素对饲料消化率的负面影响较小，具有很大的开发前景。

林波等（2009）综述认为植物提取物中的挥发油、皂苷、生物碱、萜类等化学物质具有抗菌、促生长、提高免疫力和抗氧化等功能。

并总结近年来研究发现，植物提取物还可以调控反刍动物瘤胃发酵模式，提高氮存留，减少甲烷排放的功能，因此，植物提取物作为调控反刍动物瘤胃发酵的一种重要添加剂得到了广泛的研究与应用。

目前国内外的学者已经在有效植物品种的筛选和植物提取物作用机理、剂量效应等方面的研究取得了较大进展。

文中就目前植物提取物对反刍动物瘤胃发酵调控的最新研究进展作一综述，为我国开展植物提取物作为反刍动物瘤胃发酵调控添加剂的研究提供参考。

李世霞(2009)以4只安装永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊羯羊为试验动物，探讨银杏叶提取物对山羊瘤胃发酵参数、纤维降解及各血清指标的影响，旨在寻找一种新的瘤胃发酵调控剂。

研究结论如下：①以淀粉、酪蛋白和纤维素粉为底物，探讨银杏叶提取物对山羊瘤胃体外发酵的影响，发酵时间24h，银杏叶提取物可降低pH值、NH3-N浓度、原虫蛋白产量和乙丙比，提高发酵的产气量、乙酸、丙酸、丁酸、TVFA浓度和细菌蛋白产量；②以淀粉、酪蛋白和纤维素粉为底物，探讨银杏叶提取物对山羊瘤胃体外纤维降解的影响，随着银杏叶提取物添加量的增加，纤维素降解率呈上升趋势，添加量为1.2%时，纤维素降解率可达到55.30%；银杏叶提取物可提高滤纸纤维素酶、和木聚糖酶的活性，对木聚糖酶的影响最大；银杏叶提取物可增加产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量；③通过体内试验得出：瘤胃发酵参数的结论与体外试验一致，本试验所设定的银杏叶提取物的添加范围对山羊各血清指标没有显著影响，此添加范围对山羊机体是安全的、可靠的。

2.外源微生物对瘤胃微生物和瘤胃发酵调控的影响
邓露芳（2009）研究了纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto strain RNLBSN002，BSN2）作为奶牛安全饲用微生物的应用效果，并初步探讨了其发挥益生作用的机理。

研究结果认为（1）纳豆枯草芽孢杆菌为典型革兰氏阳性杆状菌，通过对其菌落形态、细胞形态和
生理生化指标测定及其16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌属家族比对的相似结果，可判断此菌为枯草芽孢杆菌属（Bacillus subtilis）；此菌发酵黄豆后呈典型的拉丝状态，且具有纳豆激酶，符合纳豆枯草芽孢杆菌的特点。

经过优化培养条件，此菌液体发酵和固体发酵最大活菌数均达到109cfu/g或1010cfu/mL，符合作为饲用微生物的活菌数标准。

固体发酵产物氨基酸含量较未发酵豆粕培养基有总体提高。

（2）纳豆枯草芽孢杆菌在1.5×1011cfu/d的添加剂量对瘤胃体外发酵具有显著的影响。

显著提高产气量，降低瘤胃pH，提高瘤胃NH3-N、乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度。

说明纳豆枯草芽孢杆菌培养物具有促进瘤胃微生物发酵，提高瘤胃代谢产物浓度的作用。

（3）泌乳早期奶牛饲喂纳豆枯草芽孢杆菌1.0×1011cfu/d能显著提高产奶量，提高牛奶中乳蛋白和乳糖产量，提高产奶效率，降低乳中体细胞数，说明纳豆枯草芽孢杆菌具有促进奶牛产奶性能，改善乳品质的作用，并且这种效应与饲喂剂量呈线性关系。

（4）纳豆枯草芽孢杆菌可提高奶牛产奶性能。

一方面此菌促进了瘤胃微生物发酵，降低瘤胃pH，增加瘤胃NH3-N、VFA和丙酸浓度；另一方面此菌显著增加了瘤胃蛋白分解菌、淀粉分解菌、总细菌和原虫的数量，尤其增加了溶纤维丁酸弧菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、牛链球菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、埃氏巨球型菌布氏普雷沃氏菌、普雷沃氏菌短杆菌和原虫纤毛虫的数量。

说明纳豆枯草芽孢杆菌具有促进瘤胃某些瘤胃微生物种类生长的作用，促进瘤胃发酵，从而改善奶牛奶产量和乳成分产量。

3. 瘤胃微生物氮代谢研究
钟荣珍等（2009）综述了微生物氮素循环机制、微生物氮合成量的测定方法、氮素循环模型和影响微生物氮素循环的主要因素。

认为准确研究反刍动物瘤胃微生物氮素代谢会更真实的反映动物对蛋白质的消化、吸收和利用,在提高蛋白质利用率的同时减少氮素排放对环境的污染，也有助于完善反刍动物整体蛋白质周转体系，同时对于动物饲养标准的修订、饲料原料营养参数的准确性和合理配制日粮具有重要意义。

3. 瘤胃微生物多样性研究
于萍等（2009）综述了分子生物学技术在瘤胃微生态多样性中的应用进展，主要是基于16S rRNA/DNA的胃肠道微生物多样性的研究方法，包括16S DNA克隆文库技术、指纹分析技术、DNA杂交技术、基因芯片、荧光原位杂交、实时荧光定量PCR技术、竞争PCR 等
孙建凤等（2009）对瘤胃微生物（细菌、真菌、原虫）的分离、鉴定及定量分析技术进行了简要综述，分离主要包括选择培养分离法和亨氏滚管法；鉴定法主要有形态学鉴定、生理生化鉴定、血清免疫学和分子生物学技术鉴定；定量分析技术主要有传统定量方法（亨氏
滚管计数法，最大可能计数法）和分子定量方法（杂交技术，DGGE或TGGE技术，定量PCR技术）
郭同军等（2009）阐述了瘤胃微生物传统定量方法(滚管计数法和最大或然数法)和分子生物学定量方法，如探针杂交技术、荧光原位杂交、DGGE、定量PCR和流式细胞计量术(flow cytometry)等的应用状况及其各自的优缺点。

程桂英等（2009）研究了从山羊瘤胃内容物中提取瘤胃细菌总DNA，以瘤胃中两种主要纤维分解菌为目的菌种，分别依据其16S rDNA序列设计引物，利用PCR技术对其16S rDNA进行体外扩增，对扩增产物测序后进行同源性分析。

结果表明:以提取的瘤胃细菌总DNA为模板，采用PCR技术可成功地从山羊瘤胃内容物中扩增出黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌16S rDNA的特异性片段；测序后与GenBank中的序列进行比对,表明黄色瘤胃球菌与原序列(AF104841)的同源性达到99.4%，产琥珀酸丝状杆菌与原序列(AJ505937)的同源性达到94.6%。

刘烨彤等（2009）研究了慢性瘤胃酸中毒(SARA)状态下，相关瘤胃微生物数量的变化。

将6只体重相近，体况良好，并安装有永久性瘤胃瘘管的泌乳期关中奶山羊作为试验对象，以逐渐增加精料的方式诱导动物发生SARA。

试验分4期进行,4期日粮的精粗比分别为5∶5、6∶4、7∶3和8∶2。

分别采用16S rRNA探针杂交法和传统培养法对SARA状态下瘤胃内微生物数量变化进行测定。

随着日粮精料比例的增加，牛链球菌、乳酸杆菌、反刍兽新月单胞菌、埃氏巨型球菌和淀粉分解菌的数量出现不同程度的增加，而3种主要纤维分解菌的数量有所下降，其中淀粉分解菌的数量极显著增加(P<0.01)。

在SA RA状态下瘤胃细菌总数、乳酸产生菌和乳酸利用菌数量均有所增长，同时3种主要纤维分解菌的数量明显下降。

4. 瘤胃微生物特异性酶筛选研究
赵圣国等（2009）利用含有三油酸甘油酯的脂肪酶选择性筛选培养基，从奶牛瘤胃微生物元基因组文库15 360个克隆中，筛选得到了18个脂肪酶阳性克隆,其插入片段大约为60 kb，并且各个克隆的插入片段各不一样。

利用p-NPP法对脂肪酶克隆的脂肪酶活性分析，表明均具有大小不等的脂肪酶活性。

底物特异性分析表明Lipase6、Lipase7和Lipase8分别对C16底物(对硝基苯棕榈酸酯)、C12底物(对硝基苯月桂酸酯)和C16底物(对硝基苯棕榈酸酯)水解能力最强。

Lipase 6、Lipase7、Lipase 8的脂肪酶最适pH为7.5；Lipase8的脂肪酶活性半衰期随反应温度的升高而缩短，70℃时能达到30 min。

本研究所筛选的脂肪酶具有不同的底物特异性和较好的热稳定性，这对于工业化生产具有一定的应用潜力。

参考文献;
1）陆燕，王恬，石放雄等，大蒜素对瘤胃发酵和甲烷产量的影响，中国饲料2009（10）。

2)李世霞,银杏叶提取物对山羊瘤胃发酵和纤维降解机制的研究, 硕士学位论文，2009.5。

3）林波，陆燕，植物提取物调控反刍动物瘤胃发酵的研究进展，饲料工业2009（19）。

4）邓露芳，日粮添加纳豆枯草芽袍杆菌对奶牛生产性能、瘤胃发酵及功能微生物的影响，博士学位论文，中国农业科学院，2009.6。

5）钟荣珍，谭支良，反刍动物瘤胃内微生物氮代谢动力学的研究进展，华北农学报2009（24）。

6）于萍，王加启等，反刍动物胃肠道微生物多样性研究进展，中国微生态学杂志，2009（7）。

7）程桂英，赵胜军等，两种山羊瘤胃纤维分解菌16S rDNA序列的体外扩增和鉴定，黑龙江畜牧兽医科技版2009（4）。

8）孙建凤，林英庭，瘤胃微生物的分离、鉴定及定量分析技术，中国奶牛2009（4）。

9）郭同军，王加启等，瘤胃微生物定量方法的研究进展，中国畜牧兽医2009年（4）。

10）刘烨彤，刘大程等，慢性瘤胃酸中毒状态下奶山羊瘤胃细菌内几种相关细菌数量变化的研究，中国畜牧兽医2009（3）。

11）赵圣国，王加启等，奶牛瘤胃微生物元基因组文库中脂肪酶的筛选与酶学性质，生物工程学报2009（6）。

二、国外研究进展
1. 酵母培养物调控瘤胃发酵研究
由于抗生素的耐药性和残留性，科学家们着力寻找新的替代物来调控瘤胃发酵，已经有报道表明日粮添加活酵母制剂（Saccharomyces cerevisiae）可促进反刍动物健康和提高生产性能，是一种天然绿色的瘤胃调控剂，Oeztuerk H（2009）综述了活酵母在瘤胃微生态中的作用机制以及对动物生产性能的影响；Moya D（2009）对日粮改变和添加酵母培养物(Saccharomyces cerevisiae)条件下荷斯坦小母牛瘤胃微生物发酵的变化进行了研究。

2. 日粮因素对瘤胃微生物和瘤胃发酵的影响
已有报道表明饲料转化率高的奶牛（efficient）甲烷产量比饲料转化率低的奶牛（inefficient）少，但是甲烷菌在这种差异中的作用还知之甚少，Zhou M（2009）通过单独培养法对瘤胃中甲烷菌的数量和结构是否影响牛的饲料转化率进行研究。

数据表明瘤胃中的甲烷菌的种属类型及基因型对不同饲料转化率的牛的甲烷产量有重要影响；Owens D
（2009）通过饲喂玉米青贮、干草青贮和全株小麦对牛采食量、瘤胃发酵、微生物蛋白合成、血液代谢物和胃肠道消化的影响规律进行了研究；Cantalapiedra-Hijar G（2009）则研究了不同精粗比和粗料类型对山羊营养物质表观消化率、瘤胃发酵和微生物生长的影响；Wanapat M（2009）采用RT-PCR分析不同粗料水平下沼泽地水牛瘤胃食糜和消化液中主要纤维菌种群的变化规律；Hart KJ（2009）研究了青草干物质消化率对舍饲肉牛干物质采食量、甲烷产量、瘤胃发酵及微生物种群的影响；已经有研究表明日落收割的苜蓿总的非结构性碳水化合物含量比日出时高，Brito AF（2009）采用八头装有瘤胃瘘的荷斯坦奶牛研究苜蓿收割时间对营养物质消化率和瓣胃流量影响；Molina-Alcaide E（2009）通过研究草块(feed blocks)代替精料对山羊和体外单一连续培养发酵罐的瘤胃发酵和微生物生长的影响，旨在为不改变瘤胃发酵的前体下降低动物生产成本提供技术思路。

3. 饲料添加剂对瘤胃微生物和瘤胃发酵的影响
日粮添加抗生素和脂肪都有助于提高奶牛饲料转化率，它们对瘤胃发酵的作用相似，但对瘤胃微生物的影响却知之甚少，Johnson MC（2009）对体外混合培养条件下莫能菌素，杆菌肽和大豆油对瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响进行了研究；Qiao GH（2009）分两部分进行研究添加100 g/day 的活性杆菌(Bacillus) 培养物（B. licheniformis和B. subtilis两种）对中国荷斯坦奶牛瘤胃发酵、产奶量和乳成分的影响。

试验1表明，添加B. licheniformis 组产奶量和乳蛋白显著增加，未添加组和B. subtilis添加组不显著；各添加组体增重变化不显著；乳脂和乳糖组间差异不显著。

试验二利用三只非泌乳期的装有瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的奶牛进行，结果表明B. licheniformis 添加增加了进入十二指肠的微生物蛋白流量(p < 0.05)，降低了晨饲后0.5 h, 1 h, 3 h, 6 h的瘤胃液中氨氮浓度(p < 0.05)，Bacillus licheniformis 添加增加了晨饲后0.5 h, 1 h, 3 h, 6 h的瘤胃总VFA和乙酸浓度(p < 0.05)，Bacillus subtilis 添加对瘤胃发酵、十二指肠微生物氮和瘤胃营养物质表观消化率影响不显著(p > 0.05)，而Bacillus licheniformis 添加增加了瘤胃营养物质NDF、ADF和有机物的表观消化率(p < 0.05)。

4. 瘤胃微生物多态性研究
了解影响奶牛消化道微生物组成对调控这些微生物提高生产性能至关重要，尽管瘤胃微生物研究较多，但小肠微生物动态情况知之甚少，Frey JC（2009）采用微生物指纹印记比较研究了奶牛不同的消化道部位微生物群落的结构差异，方法和结果如下：从四头装有瘤胃瘘管、十二指肠瘘管和回肠瘘管的泌乳奶牛取样，基于rRNA的T-RFLP 分析表明消化道不同部位微生物群落不同(P < 0.05)，甲烷菌和微生物群落在动物间的差异不显著。

定量
PCR 分析了甲烷菌数量和原核生物基因数量的比较性相对变化情况，显微计数直接计算了十二指肠和回肠总的原核生物数量。

结论：T-RFLP比较表明微生物多态性在消化道不同部位呈现显著差异，直接计数表明微生物数量从瘤胃到皱胃再到十二指肠下降了8个数量级（每毫升细胞1012 —3.6 x 104个）。

rRNA 基因的定量PCR 分析表明甲烷菌存在于十二指肠和回肠，本研究揭示：关于小肠微生物对牛的营养和健康的影响报道还很少，需要进一步的研究；Li M（2009）则通过独立培养法PCR-DGGE技术研究了采样部位、时间和供体动物对牛瘤胃细菌多样性、发酵参数的影响。

5. 瘤胃调控和畜产品生产
通过日粮调控，改变瘤胃微生物脂肪酸转化和利用，增加反刍动物畜产品（奶、肉）中功能性脂肪酸含量（二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、异油酸和9c11t-共轭亚油酸等），促进消费者健康是目前畜产品生产的热点之一，Or-Rashid MM（2009）综述了调控瘤胃微生物脂肪酸转化和利用，提高反刍动物畜产品的健康特性这一内容的原理和技术。

6. 植物提取物对瘤胃微生物和瘤胃发酵的影响
近年来，营养学家和瘤胃微生物学家越来越感兴趣开发具有生物活性的植物化学物质作为天然的饲料添加剂以调控瘤胃发酵，如驱虫，减低甲烷生产，改善蛋白质代谢，增加畜产品亚油酸含量等，从植物中提取的皂甙、必需油脂、黄酮类和单宁等已被证实可替代化学饲料添加剂，具有调控瘤胃发酵、促进动物生产性能的作用，然而，这些物质在反刍动物生产中的有效性还没有证明是明确可靠的，Patra AK（2009）讨论了植物化学物质如皂甙、必需油脂和单宁等对瘤胃微生物（细菌、、原虫、真菌等）的影响。

7. 体外发酵模拟条件探索
Martínez ME（2009）研究了精料的稀释速率和滞留时间对Rusitec发酵罐中微生物生长、甲烷产生量及瘤胃发酵的影响，结果表明高稀释速率和较短的滞留时间有助于高精料日料在体外发酵罐更好的模拟体内发酵。

参考文献：
1）Qiao GH et al, Effect of supplemental Bacillus cultures on rumen fermentation and milk yield in Chinese Holstein cows. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl). 2009 Aug 3.
2）Patra AK, Saxena J.Dietary phytochemicals as rumen modifiers: a review of the effects on microbial populations. Antonie Van Leeuwenhoek. 2009 Nov;96(4).
3）Hart KJ et al, Effect of sward dry matter digestibility on methane production, ruminal fermentation, and microbial populations of zero-grazed beef cattle. J Anim Sci. 2009
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4）Martínez ME et al, Effects of dilution rate and retention time of concentrate on efficiency of microbial growth, methane production, and ruminal fermentation in Rusitec fermenters. J Dairy Sci. 2009 Aug;92(8)
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