核转录因子TR3及其缺失突变体在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

　3基金项目:国家自然科学基金项目(30570753;30430590;

30370586)

收稿日期:2007203212;修回日期:2008204202

作者简介:王新兴(19782),男,博士在读,从事心血管疾病分

子生物学机制的研究。△

通讯作者,E 2mail :wxxemail @s

核转录因子TR 3及其缺失突变体在酵母双杂交系统中

转录激活作用的检测3

王新兴,杨志华,刘晓华,郭东升,钱令嘉△

(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050)

摘要　目的:检测TR3及其转录活性域缺失突变体在酵母双杂交系统中的转录自激活作用。方法:采用PCR 方法扩增TR3全长序列及其缺失突变体,构建酵母双杂交系统的诱饵载体p G B KT72TR3和p G B KT72TR3/Δ1～690,将p G B KT72TR3转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β2半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:构建了包含TR3全长序列和TR3/Δ1～690序列的诱饵载体,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β2半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明β2半乳糖苷酶报告基因未被激活。结论:TR3及其转录活性域缺失突变体没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。关键词:　TR3;　酵母双杂交;　转录激活作用中图分类号:Q426

文献标识码:A

文章编号:100026834(2008)0420504204

TR3,又称为nur77或N GFI 2B ,是一种核孤儿受体[1]。TR3是一种核编码的蛋白质,在胞浆合成后,进入核内,作为转录因子,通过其DBD 与一特定的DNA 八聚体序列2Nur77/N GFI 2B 结合反应元件相互作用,或与92顺2全反视黄醇受体(92cis 2all trans retinoid X receptors ,RXR )反应元件相互作用,执行转录活性功能,调控下游基因的表达,参与多种生命活动。在血清及表皮生长因子(EGF )、神经生长因子(N GF )等多种生长因子的作用下,TR3在核内的表达增加,参与调节细胞的增殖、分化、发育。而在未成熟胸腺细胞和T 细胞杂合瘤中及AHPN (CD437)、佛波脂、视黄醇等凋亡诱导剂处理的癌细胞的凋亡中,TR3在核内的表达可被快速诱导,通过调控FasL 、TRAIL 及Nur77下游基因1和2(ND G 1、ND G 2)等下游凋亡相关基因的表达,参与多种细胞凋亡的调节[1,2]。利用酵母双杂交系统筛选TR3相互作用的蛋白质,对阐明TR3在细胞中的生物学功能及其作用分子机制具有重要意义,而蛋白质本身没有自身转录激活活性是进行酵母双杂交筛选的前提。本研究采用酵母双杂交系统,构建诱饵载体p G B KT72TR3和p G B KT72TR3/Δ1～690,转化酵母菌AH109,检测TR3及其缺失突变体是否具有自身转录激活活性。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

质粒pcDNA 2TR3、p G B KT7和酵母菌AH109

均为本室保存。E.coli DH5

α感受态细胞,琼脂糖凝胶回收试剂盒,10×pfu reaction buffer ,pfu DNA

polymerase 购自北京天为时代公司。BamH Ⅰ/EcoR

Ⅰ限制性内切酶,Taq DNA 聚合酶,T4DNA 连接酶,DNA 分子量DL2000标准购自Ta KaRa 公司产品,酵母提取物,蛋白胨购自OXOID 公司。其余试剂均为国产分析纯。核酸电泳单元及附件购自Bio 2Rad 公司产品,PCR 仪购自PE 公司。1.2　诱饵载体pGBKT72TR 3的构建

以质粒pcDNA 2TR3为模版,采用PCR 方法扩增TR3全长序列和TR3/Δ1～690。上游和下游引物分别加入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,引物设计如下:TR3全长序列:上游引物:5’2CCG G AA TTC A TGG ACCTGG CCA GCCCC 23’,下游引物:5’2CGC GG A TCC TCA G AAA G AC AA GGTGTC 23’。TR3缺失突变体TR3/Δ1～690:上游引物:5’2CCG G AA TTC CGCTGTGCTG TCTGTGG A 23’;下游引

物:5’2CGC GG A TCC TCA G AAA G AC AA GGTGTC 23’。

PCR 方法扩增上述TR3全长和缺失片段。诱饵载体的构建,参照Promega 公司酵母双杂交技术手册。PCR 产物15μl/孔进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的DNA 片段。双酶切p G B KT7和回收的目的DNA 片段,在1ml 灭菌的EP 管中加入下列反应体系(20μl ):

BamHⅠ1μl,EcoRⅠ1μl,10×K buffer2μl, p G B KT7(or prohibitin基因片段)10μl,去离子水6μl,将上述体系放入37℃水浴中孵育1h以上。于1%琼脂糖凝胶电泳分离,琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将回收的酶切产物进行连接反应,反应总体积25μl:T4DNA连接酶1μl,T4DNA连接酶10×Buffer2.5μl,p G B KT7(EcoRⅠ/BamHⅠ) 1μl,目的DNA片段1.5μl,去离子水10μl,反应体系放入16℃的水浴中过夜孵育。将连接后的产物转化 E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,1.0%琼脂糖凝胶电泳,鉴定基因的连接情况,同时将提取质粒送宝生物公司测序。

1.3　酵母菌AH109感受态细胞的制备

将酵母菌AH109菌种划线接种于YPD2A平板上,30℃培养3～5d后,挑取2～3mm直径单个克隆接种于5ml YPD培养基中,30℃,250r/min震荡培养16～18h至OD600>1.5。取5ml菌液接种到50ml YPD中,30℃,250r/min震荡培养2～3 h至OD600=0.420.6。收集菌液,室温离心2200 r/min,5min,弃上清,每50ml培养物用25～50ml 去离子水重悬,室温2200r/min离心5min,弃上清加入1.5ml1×TE/LiAC重悬。

1.4　转化酵母感受态细胞

在1.5ml无菌管中加入0.1μg p G B KT72TR3和0.1mg鲱鱼精DNA,混匀。加入0.1ml酵母感受态细胞,混匀后加入0.6ml PEG4000/LiAc,剧烈震荡10s.于30℃,200r/min震荡培养30min后,加入70μl DMSO,轻轻混匀,42℃孵育15min,冰浴1～2min后,14000r/min离心5s后弃上清,沉淀用0.5ml1×TE重悬,涂布于营养缺陷平板SD/2Trp 上,30℃孵育观察其生长。

1.5　β2半乳糖苷酶活性分析

将一片干净的滤纸平铺到长有酵母菌落的平板中,使菌落粘附于滤纸上,记下滤纸片的方向和位置,当滤纸片差不多被浸湿的时候,轻轻将其移入液氮中浸泡10s。取出滤纸片室温风干,克隆面向上平铺在用Z buffer/x2gal浸透的滤纸上,避免气泡,室温孵育,周期性检查克隆的变蓝情况。

2　结果

2.1　诱饵载体的构建

TR3编码序列全长为1692bp,TR3/Δ1～690序列长度为1002bp,以质粒pcDNA2TR3为模版,采用PCR方法扩增TR3全长和TR3/Δ1～690, PCR产物和p G B KT7质粒经过酶切(EcoRⅠ/BamH Ⅰ)、连接、转化、筛选后,获得p G B KT72TR3和p G B KT72TR3/Δ1～690质粒。将质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳,测序结果,经NC BI Blast比较,该序列与NM2031851即大鼠prohibitin cDNA编码序列完全一致(图1,图2)。以上结果说明诱饵载体

p G B KT72PH B构建成功。

Fig.1　Identification of p G B KT72TR3recombinated plasmid A:Identification of p G B KT72TR3.1、2:Recombinated plasmid;3:Negative control,4:DNA Make.B:

p G B KT72TR3recombinated plasmid sequencing

Fig.2　Identification of p G B KT72TR3/Δ1～690recombinated plasmid

A:Identification of p G B KT72TR3/△1～690.

1～8:Recombinated plasmid,9～10:Negative control, 11:DNA Maker.B:p G BKT72TR3/Δ1～690recombinated plasmid,11:DNA maker