单细胞的毛细管电泳分析

中的多种组分∀
等则同时检测了鼠
细
胞中的氨基酸 小肽和儿茶酚胺类递质∀美国
大学化学系
研究小组一直以人体红细胞作
为分析对象 这是目前单细胞 分析中最小的细
胞体∀
单细胞 分析的应用前景非常广阔 但仍存
在许多尚待解决的问题∀单细胞内组分的种类很多
而且某些组分的含量极低∀扩展检测器的范围 进行
高效灵敏的检测是实现胞内全组分分析的关键∀ 质
安培法检测 但未证实各电泳峰的成分 ∀ 其后又
采用 Λ 碳纤维微电极和内径 Λ 的毛细管柱
首次检测了蜗牛的单个脑细胞中神经递质多巴胺并
与胞内伏安法的结果进行了比较 ∀ 为进一步简化
操作 他们采用氢氟酸蚀刻的方法制作微进样器 直
接从蜗牛多巴胺神经细胞和 羟色胺神经细胞中移
取细胞质 耦合多孔玻璃接口以消除高压电场的干
谱
卷
方法保证了细胞组分的
进样 操作方便 也可
在柱上进行微量衍生化操作 适合推广使用∀
前述两种方法均为已分离的单细胞的取样方
法 而美国宾州大学
研究小组设计的细胞质
取样方法则无需将细胞分离 可直接进行活体单细
胞分析∀ 具体分为三种形式 其一 把玻璃毛细管尖
端的直径拉制成约几微米后灌入缓冲液作为微进样
器 用微操纵器控制其尖端准确插入神经细胞内 再
斑作为检测窗口∀ 等 未经荧光标记用
定量检测了人体单个红细胞内的血红蛋白和碳酸酐
酶 检测限可达亚
级 并得出细胞之间蛋白质
量的差异性∀ 等 通过检测酶催化反应的产物
测试了几种同工的乳酸脱氢酶


的酶活性 检测限达 ≅
约 个分子 ∀对于非荧光特性的单细胞组分 亦
可采用间接激光诱导荧光检测∀
等 报道了
用此法衍生 采用 可灵敏地检测单个红细
胞内谷胱甘肽的含量 检测限为
∀
等 把在柱上衍生方法用于激光诱导荧光检测 将
整个单细胞移入毛细管内 采用电迁移进样
≅
移入部分衍生化试剂和内标 直接把分离毛
细管进样端作为衍生化反应器 反应一段时间后再
将进样端插入操作缓冲液进行电泳分离检测∀ 用上
述方法衍生 分离检测了鼠噬铬瘤细胞

著 刘克球译 微电极方法 北京 北京大 学出版社
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高 鸿等 分析化学前沿 北京 科学出版社
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周伟红 吴明嘉 汪尔康 分析化学 χ
单细胞组分 分析的操作复杂 面临的问题 很多 其中最为突出的是单细胞组分的进样和电泳 分离的检测∀
瓶 再连接一个注射器 利用真空负压将人体血液红 细胞移入 Λ 或 Λ 内径的毛细管内 中止 使红细胞溶解 ∗ ∀ 相比较而言 整个细胞的取样
Ξ 国家自然科学基金资助课题
本文收稿日期
修回日期

色
神经细胞中神经递质的检测∀
最近
等提出一种 的在柱微
型免疫检测方法 电泳毛细管内填充与抗体共价键
合的胶体颗粒 在高压电场的作用下 胶体颗粒发生
迁移 利用抗原分子与抗体专一性结合作用和激光
光散射检测反应颗粒的个数 可测定不同红细胞中
葡 糖 磷 酸 脱 氢 酶
的含量 检测限达
约 个分子 ∀ 微型免疫检测灵敏度非常
第 卷第 期 年月
色
谱
文献综述
单细胞的毛细管电泳分析Ξ
胡 深 黄 波 李培标 程介克
武汉大学化学系 武汉
提 要 对单细胞分析化学中毛细管电泳分离技术的进样方式 检测器 应用和前景予以综述 引用文献
篇∀
关键词 毛细管电泳 单细胞分析
分类号
Ù
前言
进样方式 单细胞的体积非常小 一般低于
而人体的
近几年来 人们对单细胞的组分分析有了浓厚 的兴趣 ∗ ∀ 由于生物组织中各种组分分布不均一 因此进行生物微环境分析非常必要 尤其对作为一 个相对独立生物功能体的单细胞中的一些重要组分 进行高效 灵敏地检测 将有助于阐明一些重要的细 胞生理过程 如细胞间和细胞内的信息传递 细胞功 能的分子水平调节以及某些由分子缺陷导致的病理 过程等∀美国匹兹堡会议已专门组织了 单个神经细 胞的分析化学 专题讨论会 ∀一门新兴的分支学科
心 将上层清液转移到另一微型管状瓶中 加入试剂
衍生化后用移液器移取部分溶液加入电泳管内 再
分离检测∀ 这种进样方法通过校正可准确移取
的样品对单细胞组分进行预处理 例如可对非荧光
特性的化合物进行衍生化 但操作较复杂 取样的体
积也不能太小 应用的范围有限∀
另一种取样方法是整个细胞取样∀ 此法一般采
用 ∗ Λ 内径的分离毛细管 毛细管的外径用 氢氟酸蚀刻至 ∗ Λ 左右∀ 在微操纵器的控制 下 将毛细管的管口与已分离的某个特定细胞对齐
关重要 极少量的取样对细胞的损伤小 可测定单细
胞中待测物的空间分布 进一步还可检测细胞亚微
结构功能体内的组分或进行细胞膜结构分析 如神
经细胞内囊泡或突触中神经递质的含量∀另外 随着
分析对象的不断扩大 对分离的要求将越来越高 寻
求多种 分离模式 柱前预富集或 与其它分离
手段联用将有效地提高分离的效能 实现单细胞中
扰 用微操纵器把通过化学蚀刻的约 Λ 碳纤维微
期
胡 深等 单细胞的毛细管电泳分析
柱电极插入耦合毛细管的末端管口内 利用管口的
缓冲液池作为电解池 检测了上述两种神经细胞中
的多巴胺和 羟色胺的含量 移取的细胞样品体积
为∗
检测限达亚
级∀
等 用 Λ 的毛细管进行全细胞电迁移进样 耦 合多孔接口 并采用碳纤维微柱电极作探针 分离检
方法的建立
红细胞则不到 制作方便适用的微进样器对
单细胞组分取样 是进行 分离的首要步骤∀ 一般
采用电迁移进样和压力进样 但微进样器的制作和
使用则各不相同∀
等 采用微注射器压力
进样 即将微注射器连接一微量移液器 移液器尖端
极细 可直接插入分离毛细管的管口∀单个神经细胞
经分离后置于
的微型管状瓶中 匀化 再离
通过电迁移进样或压力进样把单细胞移入管内 再
用 非 生 理 缓 冲 液 将 细 胞 溶 解 进 行 电 泳 分 离 检 测∀
等 用 Λ 内径毛细管 采用
≅
的电迁移方式将 Λ 的神经细胞移入管内进
行 单细胞分析∀ 细胞移入电泳管后 如管内缓冲
液不能溶解细胞 亦可再采用电迁移进样的方式移
入一些特定非生理缓冲液将细胞溶解 ∀ 全细胞压 力进样一般在毛细管的检测端连接一个气密的管型
单个细胞的分析化学正在形成 它已成为分析 化学前沿领域中的热门课题∀
对单细胞的分析有超微电极伏安法 液相色 谱电化学检测法 微型薄层色谱法 微型玻 管 电极法 等 但由于灵敏度或选择性方面的原因 均 不能得到较准确的定量结果∀ 年代发展起来的开 管液相色谱和毛细管电泳 微柱分离方法的质 量检测限低 分离效率高 已成功地用于单细胞多组 分的定量检测 ∀ 其中 由于 可采用极细内径 的弹性石英毛细管作为分离载体 进样量小 可操作 性强 分离快速 高效 因而它在单细胞的多组分分 析中发挥着越来越重要的作用∀本文将从单细胞 分析的进样 检测器以及应用和前景几个方面对这 一新兴领域作一概述∀
的要求将不断提高 以适应多种类型化合物的检测∀
应用和前景
目前 在单细胞分析中的应用主要集中在神
经科学领域∀ 早期主要以蜗牛的巨大神经细胞作为
分析对象 分析物为神经递质和氨基酸∀随着这门技
术的不断完善 具体应用逐渐向哺乳动物的单细胞
分析过渡 分析物的种类也在逐步扩大∀
等
以牛肾上腺髓质细胞作为研究对象 分离检测了其
谱检测器是目前唯一能为亚微克级样品提供结构信
息的工具 通用性好 适合于大小不同分子的检测
已有常压电离
快原子轰击
电子
喷雾 等多种接口方式用于毛细管电泳的质谱检
测

对某些生物活性肽的检测限可达几
个
∀ 该联用技术的发展必将有效地拓展单
细胞 分析的范围∀ 免疫法检测灵敏度非常
高 选择合适的抗体 将有效地分离检测单细胞中的
一些抗原分子∀ 化学发光用于 分离检测已有报
道 对某些组分 如
的检测可达相当高的灵
敏度 可望用于单细胞分析∀
目前
用于单细胞分析的优势尚未充
分展示∀选择合适的衍生化试剂
发展高效的柱
前和柱后微量衍生化手段将有助于提高
检测灵敏度 拓展单细胞分析范围 尤其对细胞内生
物大分子如多肽 蛋白质等的检测∀ 安培法检测
把电泳管的阳极端插入微进样器中 启动高压电迁
移进样 其二 采用外径约几十微米的双微管进
样器 一微管的管尖用碳纤维密封 其内插入铂丝用
于导电 插入细胞后 用电迁移从另一管移入细胞质
样品 约∗ 体内
其三 将内径 Λ 毛细管的外径蚀刻至 Λ 直接插入多巴胺或 羟色胺神经细胞
采用电迁移方式将一部分细胞质移入毛
细管内进行电泳分离∀ 用此法最小可达到
的
进样量∀由于细胞直径小 微型进样器尖端不易准确
插入细胞内 因此该进样法目前主要用于蜗牛巨大
神经细胞的分析 对于哺乳动物的神经细胞或人体
的红细胞的活体分析尚无报道∀
检测器
单细胞内组分的含量非常少 一般在
至
的范围内 这就要求 的检测器至少能达到
级检测限 因此检测器是建立单细胞 分析
方法的关键∀ 检测器种类很多 但用于单细胞多
组分分离和定量检测的主要有电化学检测器和激光
诱导荧光检测器
∀
激光诱导荧光检测的灵敏度已达到光谱分析方
法的极限 单原子和单分子检测
与激光
诱导荧光检测相结合 兼有高分离效率和高灵敏度
的特点 因此具有很大的潜力∀ 在单细胞的 分析
中 通常将激光光束在毛细管内聚焦成非常小的光
更多组分的分离∀
综上所述 已在单细胞分析中显示出巨大的
优越性 并已得到了具体的应用∀ 随着 分离和检
测技术的不断完善 相信它在单细胞组分分析中的
应用会不断地得以扩展 将作为细胞研究的一种重
要工具而显示出广阔的应用前景∀
参考文献
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色
谱
卷
程介克 刘锦春 江祖成 痕量分析 北京 化学工业出 版社
测了蜗牛神经细胞内的多巴胺并与胞外的多巴胺含
量进行比较∀
等 采用相同的方法进行单个
多巴胺神经细胞分析时 发现溶解细胞的时间变短
会造成迁移时间不同的两个多巴胺电泳峰 并据此
推断它们是来自不同的贮存多巴胺的囊泡∀ 毛细管
电泳安培法检测器具有灵敏度高 选择性好 线性范
围宽的优点 但应用的范围较窄 目前主要用于单个
的影响∀ 一般认为 当毛细管内径小于或等于 Λ
时 可将微电极置于末端管口直接构成终柱安培法
检测器 但当毛细管内径超过 Λ 时 高压产生 的基线噪音和漂移较明显 为此 已有多种接口被用
于排除高压电场对微电流检测的干扰 ∗ ∀
研究小组采用 Λ 碳纤维微电极和内
径 Λ 的毛细管柱 通过一微进样器移取蜗牛 神经细胞的细胞质首次尝试单细胞组分的 分离
化反应难以进行彻底 同时也会降低检测灵敏度∀
等 将单个神经细胞放入
微型管
瓶中 加入萘二甲醛衍生 用微量移液器移取
溶液进样 高效 快速地分离检测了十几种氨基酸∀
等 设计一种新颖的微量衍生化方法 把细
胞放入含有衍生试剂
的溶液中
可透
过细胞膜直接进入胞内与硫醇类物质发生衍生化反
应 再把整个细胞移入电泳管内 溶解后分离检测∀
中的小肽 神经递质等 并定量测定了 种
氨基酸和多巴胺的含量∀本法操作简单 衍生化反应
器体积小 比前述微型反应管式衍生方法的体积降
低一个数量级 稀释作用减小 效果较好∀
毛细管电泳电化学检测
包括电导法
检测 电位法检测和安培法检测 种模式 ∀ 目前
只有安培法检测器可用于单细胞分析∀ 安培法检测
器需解决的首要问题是克服高压电场对微电极检测
高 适合于测定各种抗原分子的含量 用于单细胞的
分析将具有很大的潜力∀
分离模式
尽管 的分离模式很多 诸如毛细管区带电
泳
毛细管凝胶电泳
胶束电动毛细管
色谱
毛细管等速电泳
等 但在单
细胞分析中 目前的检测对象主要是一些小分子化
合物 因此一般采用自由区带电泳即可分离多组分∀
随着研究领域的扩大 单细胞 分析对分离模式
将毛细管内壁涂层后使用低离子强度的电泳缓冲液
间接检测单个红细胞中的 和
等采
用荧光素钠盐的 缓冲液作为电泳操作溶液 定
量检测了单个红细胞中的乳酸和丙酮酸 其中乳酸
的检测限可达
∀
尽管如此 单细胞内大多数组分需经微量衍生
化才可用荧光检测 胞内组分含量少 浓度低 因此
பைடு நூலகம்
不能加入过多的衍生试剂 否则由于过度稀释 衍生
亦在进一步完善 脉冲安培检测可活化电极表面 提
高检测灵敏度∀ 间接安培法 和还原电化学检测
法 用于分析一些氨基酸和双肽 检测限可低至几
个 ∀ 化学修饰电极用于 分离检测已有报
道 可有效地提高选择性和灵敏度∀ 或 电
极已成功地用于氨基酸 肽 和糖 的 分离
检测 用于单细胞组分分析具有一定的潜力∀
对单细胞电泳分析中进样器的进一步微型化至