种高通量全基因组甲基化cpg岛富集方法建立——mbd2b蛋白柱层析法

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上海交通大学工程硕士学位论文中文摘要一种高通量的全基因组甲基化 CpG岛富集方法的建立
——MBD2b蛋白柱层析法
中文摘要
背景
众所周知，肿瘤的形成是涉及到多种基因异常，最终导致细胞生长失控的病理过程。

其发生、发展在本质上是由于细胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活所致。

以往对于基因
表达异常的机制研究仅局限于分析其基因机制,包括结构改变(如点突变、缺失、插人等)
和染色体重排等。

研究发现，肿瘤细胞中存在着与正常细胞不同的甲基化模式，可分为甲
基化增强、甲基化减弱和甲基化酶 Mtase 水平提高三种类型[1] ,在早期癌、癌前病变，甚至一些良性病变中即已出现，其总体甲基化水平通常比正常细胞降低，且多伴有某些 CpG
岛甲基化程度的增高，这就是癌基因和抑癌基因表达异常、靶细胞获得增殖功能，而丧失
抑制生长功能的另一重要机制，癌变生成的表观遗传机制( epigenetic mechanism)。

以肝癌为例，筛查发现我国肝癌患者中，其癌肿瘤直径小于 5 厘米者近 50％，切除
后病人的 5 年存活率为 50％；肝癌直径大于 5 厘米者，其 5 年存活率接近 0，因此，加强肝癌的预防和高危人群的定期监测，早期发现、早期诊断、早期治疗是提高肝癌患者存活
率的关键。

高甲基化是导致抑癌基因失活的重要机制，现已证实，启动子区高甲基化导致
抑癌基因失活是人类肝癌的共同特征。

P16 是一种抑癌基因，其启动子区高甲基化与多种
肿瘤的发生相关。

研究显示，肝癌患者 P16 基因启动子区存在较高的甲基化，因此推断，
检测像 P16 基因启动子区甲基化，对于肝癌的早期诊断可能具有重要意义。

目前最常用的
甲基化检测技术，如亚硫酸氢钠/测序法、甲基化特异性 PCR、原位-MSP 杂交、单链核苷
酸引物延伸法、变性高效液相色谱法等都无法对全基因组 CpG 岛的甲基化状态进行高通
量快速的甲基化检测，MBD2b 蛋白柱层析法结合全基因组芯片方法可以解决这一难题。

目的
利用甲基化结合蛋白 MBD2b 具有特异性结合甲基化 DNA 的特性, 建立一种基于
A
DNA 免疫共沉淀技术的全基因组甲基化 CpG 岛的富集方法，分别对甲基化与非甲基化片
测，证明这种方法的富集效率及临床应用的段及肝癌患者和正常人的临床标本进行检
III
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上海交通大学工程硕士学位论文中文摘要
可行性。

同时，为甲基化异化谱的研究，为癌症的检测，诊断，分期及预后打下一个良好
的基础，对于明确肿瘤发生的分子机理及阐明表观遗传调控在人类疾病中的作用具有重要
意义。

方法
在大肠杆菌中表达重组的 GST-MBD2b 蛋白，通过 Glutathione Sepharose 4B 对重组蛋白进行纯化，制备成亲和层析柱，利用在不同的盐离子强度下 MBD2b 对甲基化 DNA 和
非甲基化 DNA 的结合能力不同，对甲基化 DNA 进行富集。

用甲基化酶 Sss I 处理过的 DNA 片段与非甲基化 DNA 片段进行富集条件的摸索，通过不同盐离子浓度的洗脱程度来确定
最佳的富集条件。

样品的富集情况分别用 Real Time PCR 及基因芯片进行检测。

Real Time PCR 是选取抑癌基因 P16 检测 GST-MBD2b 蛋白柱层析法的富集效率以及在富集时加入不
同长度的经过处理的甲基化与非甲基化拟南芥片段，经过富集后选择其中任意一种片段所
对应引物来检测这种方法对甲基化 DNA 的富集与对非甲基化 DNA 的洗脱效果。

芯片检
测是可以高通量的将上述加入的全部甲基化与非甲基化拟南芥片段的富集情况在同一张
芯片上进行检测，将加入的拟南芥片段对应的 PCR 产物作为探针，经过玻片的清洗，硅
烷化、手臂分子的连接、探针的点样及固定等多个步骤制备小芯片。

将含有甲基化和非甲
基化拟南芥片段的富集产物与芯片杂交，分析荧光信号值以反应富集情况。

此外，还可以
将蛋白柱层析法与全基因组 CpG 岛芯片结合分析正常肝及肝癌中的甲基化情况。

结果
在大肠杆菌中表达纯化了 MBD2b 蛋白，同时试验确定了 0.5M 盐离子浓度是采用
MBD2b 蛋白对甲基化 DNA 片段和非甲基化 DNA 片段进行分离的临界条件。

通过 Real
Time PCR 及基因芯片检测发现，这种方法能够实现对全基因组甲基化 CpG 岛的有效富集
且内源基因检测到的最高富集倍数可达到 100 多倍，对甲基化的富集率/非甲基化洗脱率
可达到 4000 倍左右，富集方法的稳定性重复性好。

结论
本研究建立全基因组 CpG 岛的甲基化检测新方法，实现了对多位点甲基化的检测，
并用 GST-MBD2b 蛋白柱层析法对甲基化/非甲基化片段及肝癌标本进行了富集分析，证实
了这种方法的有效性，简便性，快速性及联合芯片后的高通量性，这为研究癌症的全基因
组 DNA 甲基化异化谱提供了技术保障。

A IV
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上海交通大学工程硕士学位论文
关键词：DNA 甲基化，CpG 岛，MBD2b 蛋白，基因芯片
A 中文摘要
A
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A High-throughput Method for Whole Genome Methyl-CpG Islands
Enrichment
——MBD2b Protein Column chromatography
Abstract
Background
As we all know, cancer is caused by multiple abnormal genes, leading to uncontrolled cell growth of the pathological process. Its occurrence and development are due to the oncogene activation and inactivation of tumor suppressor genes. In the previous study, the mechanism of gene abnormal expression is confined to the analysis of its genetic mechanisms, including structural changes (such as mutation, deletion, insertion etc) , chromosomal rearrangements and so on. Studies found that (the abnormal methylations in tumor can be catergrad into 3) in the tumor and normal cells with different methylation patterns can be divided into three
[1]
types: hypermethylation high methylation, hypomethylation low methylation and the intension
of Mtase
and presence in the early cancer, cancer precancerous lesions and even some benign lesions, its
over-methylation levels are usually lower than normal cells, and more with some degree of methylated CpG island increased, that is, oncogenes and tumor suppressor gene expression abnormalities, target cell proliferation access, and loss of function in inhibiting the growth of another important mechanism of cancer formation epigenetic mechanisms.
As liver cancer for example, Chinese HCC patients was found that its cancer tumors less than 5 cm in diameter was nearly 50%, of patients after resection of the 5-year survival rate was 50%; liver cancer more than 5 cm in diameter, the 5-year survival rate close to zero, therefore, strengthen the prevention of hepatocellular carcinoma in high-risk groups and regular monitoring, early detection, early diagnosis and early treatment of which is to increase the survival rate of patients with hepatocellular carcinoma key. Hypermethylation is the inactivation of tumor suppressor gene lead to an important mechanism, has been
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confirmed, promoter hypermethylation of tumor suppressor gene lead to inactivation is the common characteristic of human liver cancer. P16 is a tumor suppressor gene and its promoter hypermethylation and
VI
,
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the occurrence of multiple tumor-related. Studies show that patients with hepatocellular carcinoma P16 gene
promoter methylation of a higher existence. Therefore inference, as of P16 gene promoter methylation, the early diagnosis of liver cancer may have important significance. Currently the most commonly used methylation detection technologies, such as sodium bisulfite / sequencing, methylation-specific PCR, in situ -
MSP hybridization, single nucleotide primer extension method, denaturing high-performance liquid chromatography etc can not complete the rapid and high-throughput detection of the whole genome
methylated CpG islands, MBD2b protein column chromatography combined with the whole genome chip
method can solve the problem.
Purpose
Use of protein MBD2b protein which has the characteristics of combination of a specific binding methylated DNA to establish an enrichment method which is based on DNA-immunoprecipitation
technology .that is used to genome-wide methylated CpG islands, respectively methylation and
non-methylated fragment and patients with hepatocellular carcinoma and normal clinical samples for testing
to prove that this method of enrichment efficiency and the feasibility of clinical application. At the same time,
the difference of methylation research, cancer detection, diagnosis, staging and prognosis lay a good foundation for the specific molecular mechanism of tumor and clarify apparent in the control of human genetic diseases important in the role of significance.
Method
Expression of the recombinant protein of GST-MBD2b in E. coli through Glutathione Sepharose 4B of
the purified recombinant protein to prepare and get affinity chromatography column . According to the different ionic strength of salt has the different effect of MBD2b to the methylated DNA and non- methylated DNA , in order to get the enrichment of methylated DNA . By demethylase Sss I dealing with the DNA fragments and non-methylation of DNA fragments enrichment condition exploration, through different concentrations of salt ions to determine the optimal elution extent of the enrichment conditions. The accumulated samples were tested by Real Time PCR and gene chip. Real Time PCR is to select tumor suppressor gene P16 to detect protein GST-MBD2b column chromatography enrichment efficiency as well as
to join in the enrichment of different length of the methylation and non-methylation fragments in Arabidopsis .
A
After the enrichment select arbitrary primers corresponding to a fragment of this method to detect the methylation of DNA and the accumulation of non-elution of DNA methylation results. Chip testing can be
VII
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high-throughput by adding all these methylation and non-methylation of Arabidopsis fragments accumulation in the same test on a chip, will join the Arabidopsis fragment corresponding PCR products as probe, after cleaning and silane slides, arm molecular connectivity, and the probe sample preparation steps such as fixed on the chip. Methylation and will contain non-methylated fragments in Arabidopsis and the enrichment of chip hybridization analysis of fluorescence signal values to reflect accumulation. In addition, the protein can
also column chromatography and genome-wide analysis of CpG island chip with normal liver, hepatocellular carcinoma and adjacent samples methylation of the situation.
Result
The experiment confirmed ion concentration of 0.5 M salt is the separated critical condition used MBD2b protein on methylated DNA and non-methylated DNA fragments . By Real Time PCR and gene chip
analysis found that this method can be achieved in the whole genome DNA methylation of the effective concentration and the highest concentration multiplied 100 times can be achieved, the rate of methylation of enrichment / non-methylated washout rate could reach more than 4000 times, good stability and repeatability.
Conclude
This study established a new method about whole genome methylated CpG island, can achieve the detection of more points on the methylated DNA. In this study, GST-MBD2b protein column chromatography
on methylated / non-methylated fragments and the enrichment of hepatocellular carcinoma specimens, it was confirmed that this method is effective, simple, fast and high-throughput after combined with gene chip and this research for the cancer genome-wide spectrum of alienation provides technical support.
Key words： DNA Methylation，CpG Islands，MBD2b Protein，gene chip
A VIII
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中英文缩略词表
中英文略缩词表
简称
HCC COBRA
DHPLC DMH HPCE HPLC
全称
hepato cellular carcinoma
combined bisulfite restriction analysis
denaturing high-performance liquid chromatography differential methylation hybridization
high-performance capillary electrophoresis high-performance liquid chromatography
中文名
肝癌
联合亚硫酸盐限制性酶切分 析
变性高效液相色谱 差异甲基化杂交 高效毛细管电泳 高效液相色谱
MCA-RDA
methylated CpG
island amplification
representationa l
甲基化 CpG 岛扩增-代表性
difference analysis
差异分析
MS-AP-PCR MS-DGGE MS-DHPLC
MS-MCA Ms-SnuPE
MS-SSCA MSO MSRE MSRF
PCR
RLGS
methylation-sensitive arbitrarily primed PCR
methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis methylation-specific denaturing high-performance liquid
chromatography
methylation-specific melting curve analysis
methylation-sensitive single nucleotide primer extension
methylation-specific single-strand conformation analysis
methylation-specific microarray
methylation-sensitive restriction endonuclease
A
methylation-sensitive
restriction fingerprinting polymerase chain reaction
restriction landmark genomic scanning
X
I
甲基化敏感的随机引物 PCR 甲基化特异的变性凝胶电泳
甲基化敏感的变性高效液相
色谱 甲基化特异溶解曲线分析
甲基化敏感的单核苷酸引物 延伸
甲基化特异的单链构型分析 甲基化特异微阵列
甲基化敏感的限制性核酸酶 甲基化敏感的限制性指纹识 别
聚合酶链式反应
限制性基因组扫描
A
上海交通大学工程硕士学位论文中英文略缩词表
SAM TLC MBD MeCPs HDAC1 5-mC DNMT BSP S-adenosylmethionine
thin-layer chromatography
methyl-binding domains
methyl-CpG binding proteins
histone deacetylase 1
5-methyl cytosine
DNA methyltransferase
Bisulfite specific PCR
XII
A 硫腺苷甲硫氨酸薄层色谱
甲基化结合结构域甲基 CpG 结合蛋白组蛋白脱乙酰酶 1 5 一甲基胞嘧啶DNA 甲基转移酶亚硫酸盐特异 PCR
A
上海交通大学工程硕士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明
上海交通大学学位论文原创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对
本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律
结果由本人承担。

学位论文作者签名：孙贝娜
日期：年月
A 日
A
上海交通大学工程硕士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书
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本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门
或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

保密□，在本学位论文属于
不保密□。

（请在以上方框内打“√”）
学位论文作者签名：孙贝娜年解密后适用本授权书。

指导教师签名：李荣秀
日期：年月日日期：年月日
第
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第一章前言
上海交通大学工程硕士学位论文
第一章前言
生命活动的完成需要生物分子的参与，核酸和蛋白质是生命体中最重要的生物大分子。

因此，对核酸和相关蛋白质的相互作用研究具有十分重要的意义。

DNA 甲基化是 DNA 与甲基化酶相互作用的结果，是 DNA 分子的重要的碱基修饰方式之一，它可以影响到核
酸的结构以及与蛋白质的相互作用等，进而影响到基因表达和疾病的发生发展，因而成为分子生物学的研究热点之一。

下面分别介绍 DNA 甲基化的相关内容。

1.1 DNA 甲基化
1.1.1 DNA 甲基化的形式
DNA 甲基化是一种基因外修饰，不改变 DNA 的一级结构，是生命活动中一种非常普
遍的 DNA 修饰现象[2]。

大量研究表明，DNA 甲基化与基因表达、肿瘤的发生发展密切相关。

DNA 的甲基化是由 DNA 甲基化酶催化 dsDNA 使其中的胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤发
生甲基化，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC）和 N6-甲基腺嘌呤(6mA)及 7-甲基鸟嘌呤（7mG）[3]
5-甲基胞嘧啶（5mC）是 DNA 甲基化的主要形式。

在高等真核生物中只发现了 5-甲基胞
嘧啶的甲基化形式。

胞嘧啶甲基化是以 S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶的第 5 位碳原子上，生成 5－甲基胞嘧啶（如图 1）。

图 1 胞嘧啶的甲基化
Figure 1 Cytosine methylation
由于 CpG 二核苷酸（CpG dinucleotide）是人类基因组 DNA 甲基化修饰的唯一位点而
A。

其中，7-甲基鸟嘌呤（7mG）很少见，N6-甲基腺嘌呤(6mA)常见于细菌和病原体中，备受关注。

并且已有大量研究报道，DNA 异常甲基化在进化过程中，绝大多数的 CpG 二
1
A
上海交通大学工程硕士学位论文第一章前言
核苷酸发生了丢失(1/16→1/25 应该不算绝大多数)，仅有占基因组约 4%的 CpG 位点得以
保留，这些 CpG 位点大都表现为甲基化[4]。

但在基因组的某些区域，CpG 二核苷酸比较
密集，因此有很多定义这种 CpG 密集区，其中 Gandiner-Garden 和 Frommer 首先提出将长
度大于 200bp，实际与预期 CG 频率大于 0.6 的 CpG 富集区，称为 CpG 岛（CpG island）[5]
的 CpG 岛。

这些 CpG 岛通常位于启动子、第一外显子，极少部分靠近基因的 3`端，在
CpG 岛中，胞嘧啶基本都处于非甲基化状态是基因具有活性的标记[6]。

1.1.2 DNA 甲基化与基因表达
DNA 甲基化对基因表达的影响已有大量研究[7,8]。

CpG 岛甲基化对基因表达的抑制作
用主要通过抑制启动子的活性来实现的。

体外基因转染实验表明，CAT（chloramphenicol acetyl transferase）基因的 Ha-ras-1 基因启动子的高甲基化显著降低该基因的表达[9]。

腺病毒区启动子区的甲基化也得到类似的结果[10]。

Singal R 研究发现[11]，成年鸡的β-球蛋白
启动子基因的 CpG 岛几乎全部甲基化时，该基因不能转录；而这个基因 CpG 岛上低甲基
化时，该基因能正常转录。

这些实验为甲基化抑制基因表达的作用，提供了直接证据。

说
明甲基化状况与基因表达成负相关性。

CpG岛甲基化对启动子活性的抑制作用机理有三，1：CpG岛的甲基化直接干扰转录
因子与调控区DNA的结合。

例如cAMP反应元件结合蛋白(cREB)，AP-2，cMyc/Myn，E2F，
NFKB等转录因子不能与其相应的甲基化结合位点相结合。

2 ：一些甲基化DNA结合蛋白
MDBP1, MDB2以及甲基化CpG结合蛋白如MeCP1，MeCP2与甲基化DNA特异结合，从而
抑制转录因子与启动子的结合[12,13]。

如图2所示，该图表示转录因子结合未发生甲基化修
饰的启动子，基因正常表达；当启动子发生甲基化修饰时，由于甲基化结合蛋白与启动子
特异结合，抑制转录因子与启动子结合，基因不表达。

3：甲基化可改变染色质结构,间接
抑制基因转录。

A
2。

在CpG 岛中，胞嘧啶基本都处于非甲基化状态。

基因组中约有60%的基因含有这样
A 上海交通大学工程硕士学位论文
Figure 2
图 2
CpG 岛甲基化对基因表达的影响
The influence of Methyl-CpG island to gene expression
第一章前言
1.1.3 DNA 甲基化与肿瘤
细胞癌变是基因表达失控的结果，而 DNA 的甲基化能引起基因表达的变化，因此，
DNA 甲基化模式的异常与肿瘤的发生发展密切相关[14-16]，主要体现在包括基因组的整体
甲基化水平降低和 CpG 岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色
体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)[17]和抑癌基因的不表达。

(1) 原癌
基因的低甲基化，大量文献报道了肿瘤细胞中癌基因 DNA 甲基化水平降低。

在化学致癌
诱发的大鼠肝癌中观察到原癌基因 c-fos、c-H-ras 和 c-Kl-ras 是低甲基化[18]。

DNA 低甲基化还发生在不同的白血病中，如原癌基因 ErbA1[15]和 bcl-2[19]。

(2) 抑癌基因的高甲基化，抑癌基因的高甲基化作为基因失活的基因机制首先是在人类散发性视网膜母细胞瘤的 Rb
基因中被发现的。

Sakai 等观察到在原发性视网膜成细胞瘤（Rb）病人 DNA 中，Rb 基因
5’端启动子和外显子高甲基化图样，但在高甲基化区未测出 Rb 基因突变。

Sakai 认为，
Rb 基因的高甲基化引起等位基因的失活[20]。

Ohtan-Fujlita 发现 Rb 肿瘤中 Rb 基因5’CpG 岛甲基化增高，并证实 Rb 启动子特异性甲基化使基因表达降低到非甲基化状态的 8％[21]。

抑癌基因高甲基化的另一个例证是肾癌中的 vonHipple-Lindau(VHL)基因，Heaman[22]等发
现肾癌细胞中 VHL 基因5’CpG 岛的重新甲基化完全抑制 VHL 基因的表达，用甲基化抑
A
制剂杂氮脱氧胞嘧啶核苷处理 VHL 基因高甲基化的肿瘤细胞可使 VHL 基因重新表达。

p16INK4a 是重要的抑癌基因,是一种细胞周期调控蛋白，通过与细胞周期蛋白依赖激酶
3
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CDK4 及 CDK6 结合而抑制后者的蛋白激酶活性，从而抑制细胞的增殖。

p16INK4a 基因
启动子5’端的 CpG 到甲基化或外显子 1A 的 CpG 甲基化可导致 p16 表达缺失，是该基
因灭活的重要途径,该基因的灭活与胃癌的发生紧密相关[23]。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。

这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑
癌基因启动子区的 CpG 岛甲基化造成抑癌基因关闭有关[24]。

由于 CpG 岛的局部高度甲基
化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测[25]，而且全基因
组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著[26] ,因此甲基
化的检测可用于肿瘤的分级。

Shinichi Toyooka 描述了肿瘤发生与异常甲基化的关系：被SV40 (Simian Virus 40)感染的人间皮细胞，其端粒酶活性上调，Notch-1 基因表达增加，肿瘤相关基因（包括抑癌基因 RASSF1A）的启动子区发生异常甲基化[27]。

Cui 等发现部分
结肠癌患者的正常肠粘液腺细胞的 IGF-2 基因印记丢失[28]。

Uhlmann 等发现不同病理类型
及不同恶性程度的神经胶质瘤细胞的 7 种肿瘤标志基因存在着不同程度的甲基化[29，30]。

因此，甲基化的研究，为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据。

1.1.4 DNA 甲基化的研究方法
DNA 甲基化在维持细胞功能和识别中起着核心的作用，DNA 甲基化模式的变化对于
人类健康有重要的意义，从不同层面上检测 DNA 的甲基化的技术研究是很必要的。

目前，
关于甲基化 DNA 分析方法的研究已有很多，归纳如表 1。

但每种方法都有一定的局限性，
因此，在选择研究方法时要根据具体实验目的选择最适合的方法。

表 1甲基化 DNA 分析方法
Table 1 The analytic methods of methylated DNA
应用方法起始基因组是否依赖于PCR参考文献
DNA的处理
全基因组范围甲HPLC酶解否Kuo et al. 1980[31]
基化的分析
HPCE酶解否Fraga et al. 2002[32]
A 4
A
上海交通大学工程硕士学位论文第一章前言
TLC
SssⅠ acceptance 酶切
无
否
否
Schmitt et al. 1997[33]
Wu et al. 1993[34]
assay
Chloroacetaldehyde亚硫酸盐处理否Oakeley et al. 1999[35]
assay
Immunochemical变性否Oakeley et al. 1997[36] analysis
单CpG位点甲基MSRE-Southern酶切否Southern 1975[37]
化的定性分析
MSRE-PCR酶切是Singer-Sam et al.
1990[38]
Methylation-specifi
c
亚硫酸盐处理是Herman et al. 1996[39]
PCR
COBRA亚硫酸盐处理是Xiong and Laird
1997[40]
Direct bisulfite genomic sequencing
Cloned bisulfite genomic sequencing 亚硫酸盐处理
亚硫酸盐处理
是
是
Frommer et al.
1992[41]
Frommer et al.
1992[41]
单
C
pG位
点甲
基
A Ms-SnuPE亚硫酸盐处理是Gonzalgo and Jones 5
A
上海交通大学工程硕士学位论文化的定量分析
第一章
1997[42]
前言
MethyLight COBRA 亚硫酸盐处理
亚硫酸盐处理
是
是
Eads et al. 2000[43]
Xiong and Laird
1997[40]
Direct bisulfite genomic sequencing 亚硫酸盐处理是Frommer et al.
1992[41]
等位基因甲基化的分析
Direct bisulfite
genomic sequencing
Cloned bisulfite
亚硫酸盐处理
亚硫酸盐处理
是
是
Frommer et al.
1992[41]
Frommer et al. genomic sequencing1992[41] MethyLight
MS-MCA
MS-DGGE
亚硫酸盐处理
亚硫酸盐处理
亚硫酸盐处理
是
是
是
Eads et al. 2000[43]
Worm et al. 2001[44]
Aggerholm et al.
1999[45]
MS-SSCA亚硫酸盐处理是Maekawa et al.
1999[46] MS-DHPLC
M
S
O
亚硫酸盐处理
亚硫酸盐处理
A
是是Baumer et al. 2001[47]
Gitan et al. 2002[48];
6
A
上海交通大学工程硕士学位论文第一章前言
Adorjan et al. 2002[49]
变化的甲基化位RLGS酶切否Costello et al. 2000[50]点的随机分析
MCA-RDA MS-AP-PCR 酶切是Toyota et al. 1999[51]
Gonzalgo et al.
1997[42]
DMH酶切是Huang et al. 1999[52]
1.2 甲基化结合蛋白
DNA 甲基化是真核细胞基因组中的一种重要的修饰方式，它对基因表达的抑制需要
特异结合于甲基化 CpG 位点(methyl-CpG , mCpG) 的蛋白因子参与, 这些特异因子称为
甲基化 CpG 结合蛋白(methyl-CpG binding proteins, MeCPs)。

甲基化 CpG 结合蛋白(MeCPs)能特异性的识别 mCpG，参与基因转录沉默。

哺乳动物甲基化的主要方式是形成 5 甲基胞
嘧啶(5mC) ，以甲基 CpG (mCpG) 形式出现。

MeCPs 特异识别 mCpG，对 mCpG 周围序
列无特异要求, 因而能广泛参与基因转录抑制。

近年来, 随着新的 MeCPs 成员的发现及对
其结构的深入认识, 使其在基因转录抑制中的作用成为研究热点。

首先研究发现含有甲基
化 CpG 结合域(MBD)的蛋白包括 MeCP2、MBD1 、MBD2 、MBD3 、MBD4 。

进一步
在数据库中搜寻发现了另外 6 种成员(表 2) [53]。

表2MBD成员
Table 2 The members of MBD
名称结合域结合甲基化DNA和组蛋白脱乙酰化
酶的相关性
MeCP2 MBD1MBD2C××C是
是
A 是相关
相关
相关
7
A
上海交通大学工程硕士学位论文第一章前言MBD3否相关
MBD4
BAZ2A/TIP5 BAZ2B CLLD8 SETDB1 KIAA1461 KIAA1887Glycosylase
At2hook ,DDT ,PHDbromodomain
DDT ,PHD bromodomain
SET
SET
PWWP
是
未描述
未描述
未描述
未描述
未描述
未描述
未描述
相关
相关
未描述
相关
未描述
未描述
此外，还有另一种类型已被证明的甲基化 CpG 结合蛋白 Kaiso[54]。

到目前为止, 主
要研究的是 MeCP2 、MBD1 、MBD2 、MBD3 这四个蛋白。

第一个甲基 CpG 结合蛋白 MeCP1 于 80 年代末发现, 最初是从小鼠肝脏中分离纯化出的, 它广泛存在于哺乳动物体细胞, 在胚胎干细胞中 MeCP1 不表达。

通常迅速分裂的细胞(如脾细胞、MEL、HEL、HeLa 细胞)中 MeCP1 丰度比低分裂细胞(如成人肝、脑、肾细胞)
低。

用含 mCpG 的双链寡核苷酸探针与核酸提取物反应, 经凝胶阻滞实验分析发现 MeCP1
至少与 12 个对称的 mCpG 结合。

最新研究发现, 组蛋白脱乙酰酶 1(histone deacetylase 1, HDAC1) 抗体可将 MeCP1 和 MBD2 从 HeLa 细胞核(缺乏 MeCP2) 中共沉淀，48kD 的
MBD2，是 MeCP1 的组分，提示 MeCP1 中可能有多个 MBD2，并通过 MBD2 与 HDAC1
形成复合物[55]。

MeCP1 介导的转录抑制与局部 mCpG 的密度相关。

MeCP1 主要抑制启动
子高密度甲基化的基因，且基因的转录抑制不能被增强子再活化。

MeCP1 也可以抑制启
动子区甲基化稀少的基因, 但这种抑制可被增强子逆转。

MeCP2 是一种 84kD 的单链多肽, 广泛存在于哺乳动物的体细胞中, 尤其在脑组织中
最丰富, 但在早期胚胎细胞中很少表达。

根据剪接方式的不同，MeCP2 存在两个亚型
MeCP2α和MeCP2β，MeCP2β与MeCP2α相比 N2 末端氨基酸的数量较少,但经缺失实
A
验分析证明这两个亚型在基因表达的转录抑制方面并没有差别[56]。

进一步采用生化和功能
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A
上海交通大学工程硕士学位论文第一章前言
实验显示 MeCP2 含有两个与转录抑制相关的结构域。

①N2 末端含有大约 70 个氨基酸的区域，能够选择性的结合到甲基化的 DNA 上，称为甲基化的 CpG 结合域(MBD)；②转录
抑制域(TRD)，能与不同的共抑制子相互作用。

MeCP2 可与单一 mCpG 结合，但其对基
因的抑制作用仍与启动子 mCpG 密度相关，这种相关呈非线性关系，在 0. 5～1 mCpG/ 100 bp 密度时结合增强，如果启动子 mCpG 密度低于这一值，基因的转录不减少[57]。

此外，在人类 MeCP2 突变能引起 Rett 综合症，一种 X 连锁的神经系统发育异常。

MBD1 又称 PCM1(protein containingMBD)，曾被认为是 MeCP1 的组分，最新的实验发现 MBD1 是一个独立的 MeCPs 成员。

人类 MBD1 基因位于染色体 18q21,编码分子量
约 66kD 蛋白，其 N 末端有 MBD 区域，此外还有 2～3 个富含半胱氨酸区域(CXXC)，是DNA 锌结合调节基序，对识别 CpG 位点甲基化和非甲基化状态有意义，而 MBD1 的 CXXC 序列功能尚不明确。

人类 MBD1 的 CxxC 序列和 C 端的差异剪切可产生 4 种异构体，MBD1v1～MBD1v4，其中 MBD1v1～MBD1v2 包含 3 个 CxxC 基序，对甲基化和非甲基
化的启动子均有抑制作用，而 MBD1v3～MBD1v4 仅含 2 个 CxxC 基序,只抑制甲基化启
动子, 研究者认为可能是通过 RNA 差异剪切产生不同 CxxC 调节 MBD1 作用[58,59]。

在对MeCP1 复合物的纯化分析中发现 MBD2 是 MeCP1 复合物的一组分，48kD，MeCP1 中可
能有多个 MBD2, MBD2 能与 Mi2/ NuRD 结合形成 NuRD/ MeCP1 复合物，对甲基化基因
发挥沉默作用。

MBD2 有两种类型 MBD2a 和 MBD2b，他们由同一 mRNA 转录而来，区别在于他们
N 末端的 140 个氨基酸长度不同，MBD2b 的要短些，且他的转录抑制作用较 MBD2a 要强。

MBD3 是 Mi22/ NuRD 复合物的成分之一，Mi22/ NuRD 复合物通过与 MBD2(MBD2a
和 MBD2b)任两种相关的形式结合到甲基化的 DNA 上。

MBD4 是一种 DNA 修复蛋白，不参与基因的转录抑制。

1.3 用于甲基化检测的基因芯片技术
1.3.1 基因芯片的概念
基因芯片是九十年代发展起来的一项前沿生物技术。

它是将大量的靶基因片段有序地高密度地(点与点之间的距离一般小于 500nm)排列在玻璃，硅等载体上，也称为基因微矩阵。

基因芯片的概念可追溯到 Southern blot 杂交技术，即 DNA-DNA 之间通过碱基配对机。