虎纹蛙胚胎发育的观察

蛙的催青和人工授精

一、目的要求

通过本实验，掌握中国虎纹蛙的催青及人工授精的操作技术，了解蛙从受精卵到变态阶段的外形变化，进一步树立蛙胚发育中动态和立体的概念。

二、仪器药品

注射器、培养皿、解剖剪、解剖镊子、解剖镜、显微镜、塑料桶、1000ml的广口瓶、吸管、放大镜、采集网。

LRH-A3（促黄体）、HCG（商品名：多情素）。

三、材料

虎纹蛙（Rana tigrina rugulosa）

四、方法

催青及人工授精

1．催青

把刚从野外捕捉到的蛙，选择雌蛙体长大于75mm和雄蛙体长大于70mm的性成熟的个体，放于水缸中。首先提高水温达到18—20ºC。取雌蛙，在腹腔注射LRH-A（注射量每只3—5µg左右），hCG(注射量每只20—30国际单位/ml)，雄蛙的注射量可酌减一半。

具体配置方法：LRH-A（100μg每支）3支加水配成40ml溶液，雌蛙剂量为0.5ml，雄蛙减半；HCG（每支10000国际单位）1支加水配成500ml溶液，雌蛙剂量1ml，雄蛙减半。

将注射后的虎纹蛙分成3桶，A桶10只雄蛙，B桶10只雌蛙，C桶5对雌雄。桶里放少量水，将纸皮箱剪开洞口后盖住桶口，以重物压上，留出透气口的同时防止蛙逃窜。

2．人工授精

精子悬浮液的制备：先用剪刀将雄蛙腹中线剖开，露出黄色或褐色的精巢，用剪刀剪下精巢，放入培养皿或研钵中。用弯头剪刀将精巢剪碎或用研钵轻轻研磨，再加适量生理盐水，用玻璃棒搅拌均匀，即可制得精子悬浮液。

用左手握住催青后即将产卵的雌蛙，腹部向上，用右手拇指和食指由前向后轻轻挤压腹部，卵即可由泄殖孔流出。把挤出的卵，收集在培养缸内，加入已制备好的精子悬浮液摇匀，使精液和卵充分均匀接触，10~15min后更换净水，洗去多余精子，经几次换水后，加入足量清水，以保证受精卵正常发育。

（三）胚胎发育的观察

取少许卵块，放在滤纸上轻轻滚动，以清除卵外之胶膜，再置于盛有清水的培养皿中，用吸管将需要观察的受精卵，移入另一培养皿中，在解剖镜下，观察各发育时期的外部形态的变化。下表为虎纹蛙正常胚胎发育时期表

五、虎纹蛙胚胎发育各时期

1.受精卵；

2.二细胞期；

3.四细胞期；

4.八细胞期；

5.十六细胞期；

6.三十二细胞期；

7.囊胚早期；

8.囊胚中期；

9.囊胚晚期；10.原肠胚早期；11.原肠胚中期；12.原肠胚晚期；13.神经板期；14.神经褶期；15.纤毛出现期(胚胎的转动)；16.神经管期；17.尾芽期；18.肌肉效应期；19..心跳期；20.鳃血循环期；21.开口期；22.尾血循环期；23.鳃盖褶初期；24.右鳃盖闭合期25.角质颌期；26.鳃盖封闭期

六、讨论：

1.在给亲蛙注射催产时，可采用皮下注射法。具体操作是：两人配合，一人抓住青蛙，另一人抓起蛙背部尾椎骨两侧的皮肤，将针头插进皮下，用手指按住注射口，打完后轻轻将催产素推开，以防从伤口溢出。

2.由于整个实验过程中分在两个地方进行，在实验室维持在水温26.0℃，而在宿舍则处于29~31℃的波动范围内，整个实验从受精卵发育到鳃盖封闭期共耗时61.51小时，对照刘丽的泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙早期胚胎发育比较研究（1）

的时间为泰国虎纹蛙发育时间总计70.4小时，中国虎纹蛙时间总计92.5小时（水温（25±1）℃），而本次实验材料为中国虎纹蛙，证明较高温度能加快虎纹蛙胚胎发育的速度。