一株产D-海因酶菌株的鉴定及离子束诱变选育
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氨基酸和生物资源
２ １ ３ （ ） １－ ０ ０，２ ２ ： ５
Ａｍｉ ｏ Ａｃｄ ｎ ｉ ｓ＆ Ｂｉｔ ｓ ｕ ｃ ｓ ｏ ｉ Ｒｅ ｏ ｒｅ ｃ
一
株 产 Ｄ一 因酶菌株的鉴定及离子束诱 变选 育 海
董妍玲 ， 唐 瑞 潘 学武 ，
（ １武汉 生物 工程 学 院 生 物技 术 系 武 汉 ４０ １ ； ３４ ５
Ｄ Ａ 聚合 酶 、 Ｎ 回 收 试 剂 盒 、 ＭＤ １ Ｎ Ｄ Ａ ｐ ８一Ｔ ｖｃ ｒ ｅｔ ｏ
购 自 ＴＫ Ｒ ａ ａ ａ公 司 ； 引物 由上 海 生 工 合 成 。１Ｂ ８ ｅ—
Ｄｖ ｅ ｅｉ 型离子注入机由合肥 中科院等离子研究所 自 ｃ
２ 武汉大学 资源与环境科学学院， 环境科学系， 湖北武汉 ４０７ ） ３０９
摘要 ： 首次报 道 了产 Ｄ一海 因酶的 巨大 芽孢杆菌 ， 通过对该 菌进行 离子束诱变 ， 获得 酶活最 高增加 ３倍 的突变株 Ｍ５ 对 ，
Ｍ５的产酶条 件进行优 化 ， 得到最佳 的发酵条件为玉米浆 １５ ， ． ％ 葡萄糖 ｌ ， ％ 油酸 １ ５ ， 化钠 ０ ５ ， 添加 ５ ．％ 氯 ．％ 并 ０ｍｇ‘ 的 Ｌ
Ｍｎ “
、
Ｚ 及 ５ ０ｍ Ｌ 的 Ｍｇ ，Ｈ ． ，０１ ｎ ０ ｇ・ ２ ｐ ８０３＂ ２发酵 ２ ， ４ｈ 酶活力可达到每毫升 ２ １９Ｕ， ．１ 比优化前突变株提高 了 ３０ ， ０ ％ 比出
发菌株提高了 ８０ 。 ５％ 关键词 ： 巨大芽孢杆菌 ； Ｄ一海 因酶 ；６ Ｒ Ａ； １ｓｒＮ 离子注入 ； 发酵 条件
１ １ 菌种 来源 ．
Ｄ—ＨＰ Ｇ。Ｄ一海 因 酶 广 泛 存 在 于 各 类 有 机 体 中 ，
但有工 业化 应用 前 景 的海 因酶 主要 来 源 于微 生 物 ， 目前 报道产 Ｄ 一海 因 酶 的细 菌 主要 有 假 单 胞 菌 属 （ ｓ ｄ 脚 ， ｓ ． ， 杆 菌属 （ ｇｏａ ｔ ｉｍ ｓ． ， Ｐｅ ｏ 瑚 ｐ ） 农 ｕ Ａ ｒｂ ｃ ｒ ｐ ） ｅｕ 节 杆 菌 属 （ ｒ ｒｂ ｃ ｒ ｓ ． ， 菌 属 （ ｌ ｔｄｕ Ａｔ ｏ ａｔ ｐ ） 梭 ｈ ｅ Ｃｏ ｒ ｉｍ ｓｉ ｓ． ， ｐ ） 芽孢杆 菌属 （ ａ ｉｕ ｐ ） 克雷伯 菌属 （，６ Ｂ ｃ ｌｓ ． ， ｌ ｓ ｆ 一 ｅ ｓ ｌ ｐ ） 肠 杆 菌 属 （ ｎｅ ｂｃ ｒｓ． ， 球 菌 属 ｉｌ ｓ． ， ｅａ Ｅ ｔ ｏ ａｔ ｐ ） 肠 ｒ ｅ
羟基 苯 甘 氨 酸 （ —Ｐ—ｈｄｏｙｈ ｎ ｌ ｙｉｅ Ｄ — Ｄ ｙ ｒｘｐ ｅｙｇ ｃ ， ｌ ｎ
行 紫外 诱变 、 波诱变 等 物理诱 变 ， 微 或使 用 甲基磺 酸
乙酯（ Ｍ ） Ｅ Ｓ 等化学试剂进行化学诱变 ， 或利用基因
工程 方 法构 建基 因工 程菌 。
本 研究从 武 汉地 区土 壤 中筛选 到一株 高 产 Ｄ一 海 因酶 的细 菌 ， 菌 的 １ｓｒＮ 该 ６ Ａ与 巨大芽孢 杆菌 菌 Ｒ 株 Ｑ １５ Ｍ Ｂ ５ １的相 似性 达 到 ９ ％ ， 定 为 巨大 芽孢 ８ 确１ Fra bibliotek 料与方 法
单， 污染小等优点而备受关注 。 Ｊ
生物 酶法合 成 Ｄ—Ｈ Ｇ包 括 两 个 反 应 ， 先 由 Ｐ 首
Ｄ一 因酶催化 ５一 海 单替代海 因及其衍生物水解生 成 Ｎ一氨 甲酰 基 一Ｄ—ＨＰ 产物用 化学 法或 在 Ｎ 一 Ｇ，
氨 甲酰基 一Ｄ一 基 酸酰 胺水 解 酶 催 化 下水 解 生成 氨
ＨＰ 由于原 料成 本 低 廉 、 物 光 学 纯度 高 、 艺 简 Ｇ 产 工
通 过对 该 菌 进 行 离 子 束 诱 变 并 进 行 培 养 条 件 的优 化， 使该 菌 的产 酶能力 比 出发 菌株 提 高 了 ８０ ， ５ ％ 为 海 因酶 法生 产 Ｄ—Ｈ Ｇ提 供 了新 的菌 种 来 源 ； 时 Ｐ 同 巨大芽 孢杆 菌相 对成 熟 的转化 系统 使对其 进 行基 因 改 造成 为可 能 ， 望获 得 高酶活 的基 因工 程菌 。 有
深层 土壤 中分 离 获得 ７ ２株 Ｄ一海 因酶产 生 菌 ， 中 从 筛选 到 酶活最 高 的菌株 Ｈ Ｍ ４ 。 Ｙ ２ Ｊ
１２ 主要 材料 ．
对 羟基苯 海 因 、 二 甲氨 基 苯 甲醛 （ Ｄ Ｂ） ５ 对 Ｐ Ａ 、
氟 尿 嘧 啶 均 购 自上 海 邦 成 化 工 有 限 公 司 ； ａ Ｔｑ
杆 菌 ， 是 首次 报 导 巨 大 芽 孢 杆 菌 产 Ｄ 一海 因 酶。 这
ＨＰ 为 侧链 的半 合成 抗 生 素 ， 羟氨 苄 青 霉 素 （ Ｇ） 如 阿 莫 西林 ） 头 孢 克 罗 等 抗 菌 药 物 ， 、 因具 有 抗 菌 谱 广 ， 毒性 小 ， 吸收快 ， 口服效 果 好 等 优 点 Ｊ成 为 国 内最 ， 紧缺 的 医药 中间 体 之 一 ， Ｄ—Ｈ Ｇ 的制 备 也 已成 为 Ｐ 国内外 的 一 个 研 究 热 点 ， 中 生 物 酶 法 生 产 Ｄ — 其
中图 分 类 号 ： ９６ Ｑ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章编 号 ：０６—８ ７ （０ ０ ０ ０ ０ —０ １０ ３ ６ ２ １ ）２— ０ １ ５
光学 纯 Ｄ一型氨基 酸作 为 医药及食 品领域 的重 要原 材料 ， 被广 泛用 于半 合成 抗生 素 、 多肽 、 激素 、 拟 除虫 菊脂 、 杀虫 剂 、 甜味剂 等生 产 Ｊ 。其 中以 Ｄ一对
（ ｎ ｒｃｃｕ ｐ ） 土 壤 杆 菌 （ ｇｏａｍ ｉｍ ｓ． ． Ｅ ｔ ｏｏｃ ｓ ． ， ｅ ｓ Ａ ｒｂ ｃ ｒ ｐ ） ｕ
Ｄｅ ｓ ｐ．， Ｏｃ ｒ ｂ ｃｒ ｍ ｓ ｈ ｏ ａ ｔｕ ｐ．，Ｂｕ ｋ ｏｄ ｒａ， Ｆｌ ｒｈ ｌｅｉ ａ—
一
从 武汉 阳逻地 区污水排 放 口以及 校 园河道 旁 的
２ １ ３ （ ） １－ ０ ０，２ ２ ： ５
Ａｍｉ ｏ Ａｃｄ ｎ ｉ ｓ＆ Ｂｉｔ ｓ ｕ ｃ ｓ ｏ ｉ Ｒｅ ｏ ｒｅ ｃ
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株 产 Ｄ一 因酶菌株的鉴定及离子束诱 变选 育 海
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摘要 ： 首次报 道 了产 Ｄ一海 因酶的 巨大 芽孢杆菌 ， 通过对该 菌进行 离子束诱变 ， 获得 酶活最 高增加 ３倍 的突变株 Ｍ５ 对 ，
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１ １ 菌种 来源 ．
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但有工 业化 应用 前 景 的海 因酶 主要 来 源 于微 生 物 ， 目前 报道产 Ｄ 一海 因 酶 的细 菌 主要 有 假 单 胞 菌 属 （ ｓ ｄ 脚 ， ｓ ． ， 杆 菌属 （ ｇｏａ ｔ ｉｍ ｓ． ， Ｐｅ ｏ 瑚 ｐ ） 农 ｕ Ａ ｒｂ ｃ ｒ ｐ ） ｅｕ 节 杆 菌 属 （ ｒ ｒｂ ｃ ｒ ｓ ． ， 菌 属 （ ｌ ｔｄｕ Ａｔ ｏ ａｔ ｐ ） 梭 ｈ ｅ Ｃｏ ｒ ｉｍ ｓｉ ｓ． ， ｐ ） 芽孢杆 菌属 （ ａ ｉｕ ｐ ） 克雷伯 菌属 （，６ Ｂ ｃ ｌｓ ． ， ｌ ｓ ｆ 一 ｅ ｓ ｌ ｐ ） 肠 杆 菌 属 （ ｎｅ ｂｃ ｒｓ． ， 球 菌 属 ｉｌ ｓ． ， ｅａ Ｅ ｔ ｏ ａｔ ｐ ） 肠 ｒ ｅ
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乙酯（ Ｍ ） Ｅ Ｓ 等化学试剂进行化学诱变 ， 或利用基因
工程 方 法构 建基 因工 程菌 。
本 研究从 武 汉地 区土 壤 中筛选 到一株 高 产 Ｄ一 海 因酶 的细 菌 ， 菌 的 １ｓｒＮ 该 ６ Ａ与 巨大芽孢 杆菌 菌 Ｒ 株 Ｑ １５ Ｍ Ｂ ５ １的相 似性 达 到 ９ ％ ， 定 为 巨大 芽孢 ８ 确１ Fra bibliotek 料与方 法
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中图 分 类 号 ： ９６ Ｑ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章编 号 ：０６—８ ７ （０ ０ ０ ０ ０ —０ １０ ３ ６ ２ １ ）２— ０ １ ５
光学 纯 Ｄ一型氨基 酸作 为 医药及食 品领域 的重 要原 材料 ， 被广 泛用 于半 合成 抗生 素 、 多肽 、 激素 、 拟 除虫 菊脂 、 杀虫 剂 、 甜味剂 等生 产 Ｊ 。其 中以 Ｄ一对
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一
从 武汉 阳逻地 区污水排 放 口以及 校 园河道 旁 的