干化学法测定谷丙转氨酶的方法学研究

干化学法测定谷丙转氨酶的方法学研究
马心林
(聊城市血液中心,聊城252000)
【摘要】　目的　建立干化学分析法在非固定采血点检测献血者血液丙氨酸氨基转移酶(A LT)活性技术。

方法　对干化学法的准确性(包括线性)和精密度进行方法学研究并与国际临床化学联合会(IFCC)推荐的速率法进行比较。

结果　干化学法测定A LT线性范围上限可达1000U/L,对速率法测定出来的高值、临界值和低值标本进行批内检测,不精密度分别为4. 59%、3.24%和3.25%。

结论　干化学法与IFCC推荐速率法的测定结果近似,可以用于街头无偿献血的初步筛查。

【关键词】　干化学法　速率法　谷丙转氨酶
Methodological study on detection of A LT with dry-chemical analysis　Ma Xinlin　Liaocheng B lood Center, Liaocheng252000,China
【Abstract】Objective T o establish a method for blood A LT assay using dry-chemical analysis.Methods The accuracy including linearity and precision of the dry-chemical analysis com pared with those of kinetic method recommended by IFCC.R esults The maximal limit of linear range for measuring A LT by dry-chemical analysis could reach1000U/L.The within-run im precision was4.59%,3.24%and3.25%for high,critical and normal A LT values,respectively.Conclusions Dry-chemical analysis can be used for preliminary screening of blood donors.
【K ey w ords】K inetic method　M icrotiter plate method　A LT
干化学法测定谷丙转氨酶(丙氨酸氨基转移酶,
A LT)是根据丙酮酸氧化酶反应原理制备的试纸条
方式,使用专用机器自动检测全血、血清、血浆中
A LT活性浓度。

操作简便、快速、易于掌握。

直接采
集毛细血管血或静脉血测定。

本项技术在采供血单
位用于街头无偿采血的初筛工作,明显减少了因
A LT不合格所造成的血液及相关材料浪费。

本文就
此方法的应用进行报道。

方法原理:A LT催化L—丙氨酸和α-酮戊二酸
生成丙酮酸和L-谷氨酸,丙酮酸氧化酶(PY OD)催
化丙酮酸和H2O及O2生成丙酸和H2O2,过氧化物
酶(POD)再催化H2O2、4-氨基安替比林(4-AAP)
和酚生成醌亚胺和水,此即为著名的T rinder反应。

醌亚胺的最大吸收峰在510nm左右,连续监测
510nm吸光度变化可直接映丙酮酸生成量,其与
A LT活力成正比,可反映A LT活性,反应式如下:
L-丙氨酸+α-酮戊二酸A LT
丙酮酸+L-谷
氨酸
丙酮酸+2H2O+O2PY OD丙酸+2H2O2
2H2O2+4-AAP+酚
POD
醌亚胺+,2H2O2
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　仪器　奥林帕斯自动生化分析仪(Olym pus AU-400,日本)、艾科浦超纯水机(AUP-4-150G-2,重庆)、全自动加样仪(Microlab ST AR和AT2Plus, H AMI LT ON,瑞士)、酶标仪(ANTH OS htⅡ,澳地利)、孵育振荡仪(ANTH OS,澳地利)、离心机(国产)、干化学分析仪(Refiotron Plus,瑞士),-30℃低温冰柜(国产),普通冰箱(海尔)。

1.1.2　器材　5ml、10ml、20ml试管,0.5ml、1.0mld 刻度吸管和10ml可调定量移液器、微量移液器(32μl)。

1.2.3　试剂　A LT检测试剂盒由北京中生公司提供,批号为20021101;干化学法试纸条由罗氏公司提供,批号分别为200204,200303;去离子水为艾科浦
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齐鲁医学检验　2004年第15卷第6期　Qilu Journal of Medical Laboratory Sciences,2004,V ol15,N o.6
超纯水机生产,pH 为5.9;T ritonX -100为国产,用前配制成1%的水溶液。

1.1.4　质控血清　由罗氏公司生产,为冻干粉,批
号:200304。

使用时,用1ml 奥氏吸管吸取1ml 去离子水,小心置入冻干粉瓶(溶质)中,轻轻振荡后静置至少30min ,放入2～8℃冰箱保存待用。

1.1.5　血液样本　来自本市街头无偿献血者。

1.1.6　鼠肝脏组织匀浆　取体重250～300g 的禁
食雄性S D 大鼠。

1.2　方法
1.2.1　干化学分析仪操作步骤严格按照仪器操作
规程进行。

1.2.2　速率法测定参数　主波长:340nm :副波长:
405nm :反应方向:+:样品:10μl :试剂:200μl ;测定读点:第一点为4,第二点为14;因数:3376。

因数按以下公式计算:
因数T V ×103ε×S V ×L =0.21×103
6.22×
0.01×1=3376
公式中T V 为总反应体积;ε为NADH 的克分子消光系数;S V 为样品体积:L 为比色杯光径。

在每个工作日开机后,实验室应用自建的仪器精密度检测程序对仪器进行常规的精密度检测,只有仪器不精密度(C V )小于1.00%时,仪器方可开始工作[1]。

干化学法测定原理也是速率法原理,但是为了与国际临床化学联合会(IFCC )推荐的速率法相区分,本文将干化学法称为干化学法,将IFCC 推荐的速率法称为速率法。

1.2.3　干化学法测定A LT 准确性的评价
(1)线性范围测定标本制备　将雄性S D 大鼠
肝脏,用生理盐水洗去肝脏血管中残存血液,用面巾纸将肝脏表面水分吸干,将肝脏包膜和韧带去除,剪成0.5cm 组织块,置入匀浆器中制成肝组织匀浆。

按1:1比例向组织匀浆中加入1%T riton X -100溶液,振荡混匀,在4℃下放置10min ,3000r/min 离心10min ,取上清液加入等量甘油制成50%组织匀浆甘
油溶液备用。

(2)线性范围测定　用10ml 刻度吸管吸取生理
盐水9ml ,分装在9个10ml 玻璃试管中,每试管1ml ,用记号笔标上1-9号,用1ml 可调移液器吸取肝组织匀浆1ml 加入1号试管内混匀,再自1号试管吸取1ml 混合液加到2号试管中……,依此类推一直
加至9号试管,以倍比稀释方式稀释至1:512倍。

将稀释的标本用干化学分析仪测定,操作方法见1.2.1,并将测定结果A LT 活性(X )与稀释倍数(Y )计
算直线回归方程。

1.2.4　干化学法测定A LT 的精密度评价　按上述
测定参数,使用Olym pus AU -400自动生化分析仪,对本市无偿献血者血样进行检测后,从中分别挑选出低值、临界值、高值3份样本做为值控血清,用干化学法分别检测,同一样品各同时测定20次,计算均值、标准差和变异系数(C V ),此C V 值又叫批内不精密度;将同一样品一天测定2次,连续7个工作日或以上,全部结果计算均值、标准差和C V ,此C V 值又叫日间不精密度。

要求批内不精密度≤5.0%,日间不精密度引≤5.0%,精密度计算见下列公式:
C V (%)=
S D
x
×1002　结　果
2.1　线性范围测定　不同稀释倍数的禁食大鼠肝
组织匀浆液的干化学法检测结果见表1。

表1　干化学法线性测定结果
T abl1　Linearity of dry -chem ical analysis
比稀释度原液1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:512
测定值8791340115068736419410855.828.719.4
从表1自后向前可看出:从1:512至1:4期间呈良好的倍比关系,而自1:2至原液结果不成倍比关系,甚至原液的A LT 测定值低于1:4稀释的肝组织匀浆标本,仅为879U/L 。

为更清楚地显示干化学法的线性情况,作者对倍比稀释度数据资料进行了图形处理,从图中做进一步的比较,见图1。

使用上述数据计算出曲线的回归方程为Y =0.0002X -0.0075,r =0.995,P <0.001。

图1　干化学法的线性检测结果
Fig1　Linearity of dry -chem ical analysis
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42・ Qilu Journal of Medical Laboratory Sciences ,2004,V ol15,N o.6　齐鲁医学检验　2004年第15卷第6期
从图1可见干化学法线性范围上限值为1000U/L。

其线性测定范围要高于IFCC推荐的速率法。

2.2　干化学法检测A LT的精密度
2.2.1　批内精密度　使用干化学法同时对高值、临界值、低值定值血清测定20次,计算均值、标准差和变异系数,见表2。

由表2看使用干化学法测定的高值、临界值、低值以及定值血清结果的批内不精密度分别为4. 59%、3.24%、3.25%和1.80%,结果均在允许范围内。

表2　干化学法检测A LT定值血清批内测定结果
T ab2　W ithin-rum values of A LT detected by dry-chem ical analysis 样本高值临界值低值定质血清速率法单位89401148.86
检测次数20202020
平均值(U/L)82.4339.5211.747.86
标准差(U/L) 3.78 1.280.380.86
变异系数(%) 4.59 3.24 3.25 1.80
2.2.2　日间精密度　使用干化学法测定质控血清,每天测定一次,连续测定两遍,测定10d,计算均值、标准差和变异系数,见表3。

表3　干化学法检测A LT质控血清批间测定结果
T ab3　Between-run values of A LT detected by dry-chem ical analysis 批号靶值检测次数均值标准差CV(%)
2003041049.82047.880.94 1.96
由表3看干化学法测定质控血清结果的日间不精密度为1.96%,该方法的精密度非常好。

3　讨　论
丙氨酸氨基转移酶(AT L)是肝脏疾病的常规检测指标。

为防止输血传播病毒性肝炎的发生,在没有特异性病毒诊断试剂普及之前。

A LT检测目前在国内外仍为献血者血液筛查的一项常规而重要的项目。

过去,国内大多数采供血单位对街头无偿献血者不进行血液的初步检测,造成大量血液及相关材料与试剂的浪费。

干化学法检测A LT无论从操作上,方法的灵敏性、稳定性、还是结果判断的科学性、准确性均符合标准,符合血液检测的自动化、规范化、标准化要求。

笔者采用罗氏公司提供的质控血清分别对几台干化学分析仪进行重复性测定,结果变异系数均小于3%(资料未公开)。

对质控血清进行批内检测、日间检测,其不精密度分别为1.80%和1.96%;对使用速率法检测出来的高值、临界值和低值标本进行批内检测,不精密度分别为4.59%、3.24%和3.25%。

干化学法线性测定上限可达1000U/L,要高于速率法。

但是由于测定成本偏高、不能大批量自动测定样品,还不能取代使用自动生化分析仪进行A LT测定。

另外,使用于化学法检测A LT的影响因素要考虑以下几个方面:(1)加样器的精密度:主要通过样品中酶活性与试纸条上底物浓度关系的非系统误差影响测定结果;(2)环境温度:环境温度对干化学法测定有一定影响;(3)样品质量:干化学分析仪使用的质控物须为厂家提供的专用质控物,市场上销售的常规生化质控物不能用于干化学法的质量监控,笔者有待进一步研究,同时也希望得到同行指教。

另外,如果吸取的标本中有气泡,也会影响检测结果。

参考文献
1　李研,张孝山,潘彤,等.应用对硝基酚溶液检测生化分析仪精密度[J].天津医药,2003,31(6):390-392.
2　叶应妩,王毓三.(中华人民共和国卫生部医政司)全国临床检验操作规程[M].第2版,南京:东南大学出版社,1997:602-603.
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齐鲁医学检验　2004年第15卷第6期　Qilu Journal of Medical Laboratory Sciences,2004,V ol15,N o.6 。