在转基因植物中利用植物凝集素防治害虫的研究

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王志斌等：在转基因植物中利用植物凝集素防治害虫的研究
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量使发育延迟 !! " # 天。 玉米螟 （ $%&’()*+ ,’&+ -’&)&， ： （3445） 以 !6 种凝集素饲 !"#$%&%’ &()%*’*%" ） ./*(0* 和 1*+2 喂玉米螟，实验表明 789、 其 1.=5 值分别为 5 " =4 及 5 " >? :;9 在 !< 高浓度时有效 ， 约相当于饲料中含 5 " 56< 789、 @2 A 2饲料， 5 " 5>< :;9。与 789 结构相似的水稻凝集素 及来自一种草 +,$-./$(0 $1.1&" 的凝集素也对玉米螟有活性。 长角叶甲 （ ,’&@ &’’BC’&@， ： 2%’)$-#%3’ D(),E)D） ./*(0* 实验表明 789、 :;9 可抑制 F5< 的 虫重。来源 4$’&#5%" 5/10’*%" （ $G1） 凝集素在 !< 水平上致死率为 355< ， 但由于 $G1 的热 不稳定性， 后来的实验结果有些不一致。 灰褐 飞 虱 （ HE,) -&’C+ (0*+BI’(()&， 及黑尾叶蝉 （ &E,) 0)*JI ’(()&， 40.-’&’#’ *(,1&" ） ： 在 5 " 3< 水平上雪花莲凝集素 （ 8’*’&#5(" &%9’*%" *220%BE+E+， 、 61.5-#1##%7 3%&3%#1." ） 8K9） 789 对 3 龄、 同对照相比死亡率大于 >=< ； ? 龄灰褐飞虱作用都非常明显， 789 对黑尾叶蝉的 致死率为 3=< ， （ C A L） 人工饲料饲 8K9 的致死率为 #>< 。 ;’C)00 等人以 8K9、 789 5 " 3< 喂灰褐 飞 虱， 而 且 8K9 的 抗 性 效 果 最 佳 （ ;’C)00 等， !FI 内 降 低 蜜 汁 分 泌 46< ， 344=*； 。但豌豆凝集素对黑尾叶蝉成虫则没有效果。此外 789、 豌豆凝集素等 = 种凝集 344=-） 素也能减少马铃薯叶蝉成活时间 （G*-E-E 等， 。 344?） 蚜虫： （344=） 等发现在含有 5 " 3< 8K9 饲料中绿桃蚜死亡率为 !=< ， 存活下 GE0M)& 等 的蚜虫也显著小于对照。伴刀豆凝集素 9 对豌豆蚜有作用。结合几丁质的凝集素 789 及 DBE+2E+2 +)BB0) 0),BE+ （NO1） 等在 ! " =@2 A @0 浓度时对卷心菜蚜有显著致死作用。以 8K9 其 1.=5 P 3? ! 。 ?5 ! @’0 A 1 人工饲喂时桃蚜若虫死亡率为 F!< ， @’0 A 1（ Q*%LE’+ 等， 3446）
9 同翅目害虫的危害性
保护作物免受害虫危害是种植者和科学家所面临的一项恒久的挑战。在全世界范围 内每年因虫害造成的损失约占农作物总收获量的 !PQ ， 每年损失约数千亿美元。苏云金 芽孢杆菌形成芽孢时产生的一种不溶性的伴孢晶体蛋白— — — （ ， 一直 +内毒素 +2-DB?BN*-） ! ! 作为生物杀虫剂广泛应用于防治各种农作物上的害虫。#" 年代转基因植物研究兴起以 来， 转 ! 8 $ 杀虫基因研究方兴未艾 （郭三堆， 。与使用杀虫剂相比转基因技术有其 !RRS） 优点： 在害虫易于防治的幼龄期而不是在成虫期起作用； 在植株内部表达杀虫蛋白从而在 整个生育期发挥作用， 避免了由于杀虫剂降解不得不多次喷洒的问题； 对环境污染亦较小 等。在我国， 八五期间本室由 #TP 重点项目资助的转 ,I ? 抗虫棉花基因工程研究取得突破
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" 植物凝集素的人工பைடு நூலகம்喂虫试
利用人工饲喂实验可以较快筛选效果好的抗虫蛋白， 从而加以克隆， 然后用于转基因 研究。早在 +,-N 年 O"%I&% 等人首先实验表明饲料中含 + P KQ 黑豆凝集素 （ ;R6）时导致四 纹豆象 （ *"++,-,.(#/$#- 0"/#+"1#- ） 幼虫死亡， 并提出是由于凝集素存在的原因。但后人研 究发现是污有! <淀粉酶抑制剂所致。+,3A 年 5"9&)18/& 实验表明 ;R6 对四纹豆象的幼虫 具有毒性。’82#1(D 等 （+,,K） 用 +- 种植物凝集素对豇豆象以 K P @Q 及 + P KQ （ S > T） 饲喂， 结果 L 种植物凝集素 （桑橙凝集素、 花生凝集素、 、 曼陀罗凝集素、 土豆凝集素） 显著抑 456 万方数据 制 * 2 0"/#+"1#幼虫发育， 其中以 456 效果最好， K P @Q 剂量使发育延迟 N P L 天； + P KQ 剂
" 植物凝集素的生理作用
植物凝集素在植物界的广泛分布及其在植物体内的丰富程度足以说明它们在植物中 的地位十分重要。植物凝集素在不同植物中及同一植物不同组织中的结构、 分布的多样 性， 表明其在进化过程中适应并产生了许多独特的功能 （ ?,@023， ： !)5(； C2D9:;B， !))(） （!） 在种子成熟、 萌发过程中发挥作用。如充当储存蛋白或对储存物质进行包装、 运 输等，或兼具有保护种子而免于动物取食的作用； （"） 作为植物胚细胞的促有丝分裂因子； （$） 作为植物与微生物的共生介质。如根瘤菌就是由寄主的外源凝集素识别， 从而使 固氮成为可能； （4） 植物凝集素可以抵御细菌、 真菌、 病毒等病原体的入侵。如麦胚凝集素 （ EF2:, 对绿色木霉 （ %$&’()*"$+, -&$&*" ） 孢子的萌发及菌丝的生长有抑制作 G239 :GG0D,/;/;， H%I） 用。对棉花凝集素的研究表明， 棉花不同品种抗病能力与其种子浸取液的血凝活性成正 相关， 并观察到浸取液及其分离的蛋白质组分能显著抑制棉花枯萎病菌丝的生长； （(） 植物凝集素具有抗虫性。 万方数据
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植物学通报
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! 植物凝集素对害虫的作用机理
植物凝集素的作用机理至今未研究得十分清楚。其作用机理可能与凝集素特异结合 到昆虫肠内某处的糖辍合物有关 （!"#$%& 和 ’$()&"*， 。 +,,-； ./012% 等， +,33） （ !"#$%&%" ’#(’#()" "77*89$%$% ， 结构与功能实验研究表明， 456 和羊蹄甲凝集素 :;6） 对初孵玉米螟幼虫毒性是由于凝集素的特异结合所致， 以溴化氢处理 456 导致其不能 形成正确的二聚体， 不能结合到 !<乙酰葡萄糖胺， 从而失去对玉米螟幼虫毒性作用， 这表 明 456 毒效与其二聚化和结合到糖残基上有关。 :;6 琥珀酰化后显著改变了其构象和生物学活性。琥珀酰化的 :;6 不能结合 !<乙 酰葡萄糖胺， 而失去对初孵玉米螟幼虫的作用。而其它对 :;6 修饰， 只要不失去其对 !< 乙酰葡萄糖胺的结合能力， 即保持其抗虫性。故 :;6 活性是与其能结合 !<乙酰葡萄糖胺 有关。 分别以含有 + =7 > =* 456， :;6， ?"("*$% 及西红柿凝集素的饲料饲喂初孵玉米螟幼虫， 其中只有 456 和 :;6 与对照相比显著降低虫重。光学显微镜检查饲喂 456 和 :;6 的 幼虫， （ B"9 01#C） 总量及围食膜内的食物， @A 小时内明显减少脂体 -@ 小时后见不到脂体和 围食膜； 扫描电镜则观察到 @A 小时后围食膜遭到破坏， 在围食膜的前面区域形成几个较 大孔洞， 这些孔导致食物颗粒或者细菌通过此保护屏障， 到达或者损坏上皮细胞， 对围食 膜的损坏逐渐严重并向后发展， -@ 小时时已观察不到围食膜。 以生物素化的 456、 :;6 等为探针印迹检测发现， 456、 :;6 强烈结合到围食膜提取 此蛋白可能是形成围食膜的主要成分。推测对此蛋白的结合是 出的一 @@ DE 蛋白上， 456、 :;6 对玉米螟幼虫抗虫性原因所在。此外还发现导致玉米螟显著死亡的凝集素也 能强烈结合到纹缘膜上。 总之， 以下几种相互作用极有可能发生 （ F)2$/G&&*/ 和 H"$D)&*， +,,+； FI"G*" 和 J"%7， +,,K； ;&8="%/ 等， +,,L） （+）凝集素结合到围食膜的几丁质上； （@）凝集素结合到围食膜的糖辍合物上； （M）凝集素结合到中肠上皮细胞暴露在表面的糖辍合物上； （A）凝集素结合到糖基化的消化酶上； （L）凝集素结合到受体植物的糖基化蛋白上， 而使此蛋白不能被消化。
! 植物凝集素定义的不断深化
早在 !555 年， 俄 6738, 大学的 .239:; <,/009:3= 偶然间观察到蓖麻籽的蛋白提取物能 凝集血红细胞， 从而开始了植物凝集素的研究。但直到本世纪 >- 年代， 人们认识到凝集 素在生物体内具有多种重要生理功能， 在医药、 农业上具有巨大应用前景， 凝集素的研究 文献才开始大量涌现 （ ?,@023， 。植物凝集素 （ 02A,/;B） 一词来源于拉丁文 “ !"#"$" ” 意思 !)5(） 是选择， 以强调其能选择性地与糖复合物相结合的特性。一般说来， 植物凝集素是指能可 逆结合特异单糖或寡糖的蛋白质。但伴随着植物凝集素家族成员的增加， 对其结构、 功能 研究的深入， 分子生物学水平上新的发现， 植物凝集素的定义已几经修正。最近 C2D9:;B 等认为一蛋白质被定义为 02A,/; 的唯一前提是至少应有一个非催化结构域， 且其能可逆 结合在特异碳水化合物上。因此， 现在植物凝集素定义为： 含有至少一个非催化结构域并 能可逆结合到特异单糖或寡糖上的所有蛋白质 （C2D9:;B， 。 !))(）
" 为国家 #TP 计划重点技术项目内容并受中华农业科教基金部分资助。 万方数据 收稿日期： 接受日期： 责任编辑： 程红焱 !RR#+!U+!# !RRR+"!+"R
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王志斌等：在转基因植物中利用植物凝集素防治害虫的研究
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性进展， 通过花粉管通道法以及农杆菌介导转入我国主栽棉花品种中棉 !" 号、 晋棉 # 号 及泗棉 $ 号等中。目前， 在安徽、 山东、 山西三省已分别审定了国家抗虫棉 （ %&） %&’!、 %&’ 必将给亿万乡亲带来巨大收益。但 *+ , 的杀虫范围 !"、 %&’!(’!， !))) 年将推广几百万亩， 虽然包括鳞、 鞘、 双翅目及螨、 线虫， 却不抗同翅目害虫， 而同翅目害虫如蚜虫、 褐飞虱、 叶 蝉等在世界范围内危害都很严重。这些害虫具有刺吸式口器， 为害农作物、 园艺作物及观 赏植物。其取食不仅引起了作物的直接损失， 而且口器刺入时产生伤口， 通过伤口 !-- 多 种致病病原菌得以侵染植物， 从而导致作物更严重的损失 （ ./0123， 。在我国， 以 !))4 !))(） 年中国农业年鉴记载为例： 损失小麦 # 亿公斤， 棉花上棉 !))$ 年小麦麦蚜中等偏重发生， 蚜中等发生， 损失 $--- 万公斤， 而稻飞虱危害则导致水稻损失 ( 亿公斤。来源于植物的 凝集素经人工饲喂及转基因植物虫试表明可有效防治同翅目害虫及一些鳞翅目害虫。
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植物学通报
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在转基因植物中利用植物凝集素 防治害虫的研究 !
王志斌 张秀梅 郭三堆
（中国农业科学院生物技术研究中心 北京 !"""#!）
摘要
植物凝集素对包括同翅目在内的害虫具有有效抗性作用。本文就同翅目害虫的危害性、 植物凝
集素定义的不断深入认识、 植物凝集素在植物体内的生理作用、 对害虫的作用机理、 并对人工饲喂害虫 实验及转凝集素的抗虫基因工程研究进展、 存在问题等方面作一阐述。 关键词 植物凝集素，同翅目害虫， 作物损失， 抗虫性机理， 转基因植物